目的：　　本实验拟提出如下问题:白癜风的稳定期和进展期的是否有相关蛋白质存在差异？我们预采用两种不同的蛋白质组学2-DE和iTRAQ来分别检测白癜风不同分期与健康对照组之间的差异蛋白进行比较分析，及其网络互作的关系找出新的通路，根据蛋白质组学筛选出的高富集因子进行功能学验证与蛋白质组学的表达是否一致，并且能否筛选出有意义的因子作为血清生物标志物？通过蛋白质组学筛选和临床总结进一步提出一个假说:带状疱疹病毒能否成为诱因作为抗原肽段通过T淋巴细胞识别发生级联反应引起黑色素细胞的脱失导致白癜风？为解决上述问题，本实验首先利用蛋白质组学技术筛选鉴定出白癜风的不同分期的差异蛋白，分析出新的分子功能和通路;其次进一步行白癜风血清中的功能性验证以找到血清标志物。最后根据蛋白质组学筛查的分子机制对带状疱疹病毒是否能作为T淋巴细胞识别抗原的诱因进行探讨，为研究白癜风的发病机制找到新的理论依据。　　方法：　　一、2-DE双向凝胶电泳蛋白质组学筛选　　采用双向凝胶电泳技术筛选白癜风不同分期可能相关的血浆差异蛋白。白癜风稳定期和进展期各10例与正常组10例分为三组，等量混合不同研究组别的血浆样品，并采用Clean-Up试剂盒进行预处理后，测定样品蛋白浓度，用双向凝胶电泳分离蛋白质，凝胶经过考马斯亮蓝染色后进行凝胶图像分析。胶内酶解差异蛋白点，并串联质谱鉴定。　　二、iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选　　收集白癜风患者稳定期和进展期血清各10例与正常对照组血清10例，提蛋白后去除高峰量蛋白，然后用trypsin进行蛋白酶裂解、烷基化、酶解得到肽段。用iTRAQ试剂多重标签标记肽段，混合后运用离子交换柱分离，最后用MALDI-TOF/TOF质谱鉴定得到差异蛋白。最后通过Uniprot和Cytoskpe软件进行生物网络分析，预测差异蛋白在生物网络中的关系。　　三、白癜风不同分期相关差异蛋白的Westernblot的表达验证　　选择高富集细胞因子SERPINA5（共同上调）、LUZP4（共同下调）和脂质相关蛋白PON1及APO（载脂蛋白L1和载脂蛋白E），收集白癜风共40例样本分为稳定期和进展期2组和正常组20例进行westernblot蛋白水平验证，按照蛋白提取法提取血清中蛋白;BCA检测蛋白浓度;经制胶、跑胶、转膜、封闭、一抗、二抗、ECL显色并拍照，观察蛋白表达变化。　　四、白癜风不同分期相关差异蛋白Elisa的蛋白水平验证　　进一步验证高富集细胞因子SERPINA5进行酶联免疫吸附实验，收集58例白癜风稳定期和进展期样本分为两组和对照组30例，按照抗原包被、封闭反应、依次加入待测血清样本、酶标抗体及底物，最后终止液显色，上机检测吸收比值的变化。　　五、白癜风进展期患者的HLA SBT的分型　　对80例白癜风进展期患者进行HLA-A位点的分型，提取血液样本的DNA，纯化后OD260/280在1.7-1.9之间。扩增基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物，纯化，测序反应ABI3100。　　六、两种生物信息学软件预测VZV抗原肽段　　利用SYFPEITHI和BIMAS两种表位预测软件，对VZV抗原67个编码基因在MHC结合位点A*0301上出现的频率分析给予一定的分值，矩阵法按照分值大小进行排序，在2％最高分的排序预测多肽中可找到最佳预测表位。　　七、利用ELispot方法筛选带状疱疹病毒针对HLA-A3型白癜风的阳性抗原肽段　　提取白癜风的PBMC细胞与VZV阳性肽段共孵育;用IFN-γ抗体包被，封闭和细胞激活前期准备;洗板，加入分泌性抗体和Streptavidin-HRP室温孵育，洗板，显色，Elispot计数仪计数斑点，统计分析。　　结果：　　一、两种蛋白质组学筛选白癜风不同分期的差异蛋白表达　　1、2-DE筛选白癜风不同分期的差异蛋白表达　　利用双向凝胶电泳和质谱分析的蛋白质组学技术筛选白癜风不同分期的差异蛋白表达结果发现共34个差异蛋白，其中白癜风稳定期与正常组相比，差异蛋白表达上调9个，下调6个;进展期与正常组相比，差异蛋白表达上调8个，下调5个;进展期与稳定期相比，差异蛋白表达上调5个，下调2个。差异蛋白在进展期和稳定期都有的高富集因子包括载脂蛋白APOE，补体C3、C4 C1q等，仅在进展期筛选出的差异蛋白有过氧化物酶6，而进展期与稳定期比较的差异蛋白有甘露糖结合蛋白C，补体C4A和C4B。　　2、iTRAQ筛选白癜风不同分期的差异蛋白表达　　利用同位素标记的相对和绝对定量的蛋白质组学（iTRAQ）筛选白癜风不同分期的差异蛋白共227个，其中稳定期与正常组相比，差异蛋白表达上调42个，下调38个;进展期与正常组相比，差异蛋白表达上调56个，下调33个;进展期与稳定期相比，差异蛋白表达上调23个，下调48个。其中，与正常组相比，白癜风的不同分期筛选出的高富集因子包括丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINA5)、亮氨酸拉链蛋白(LUZP4)、基质蛋白酶(MMP9)和免疫球蛋白轻链重链等;而仅在白癜风稳定期筛选得到的高富集因子包括PLCH2、维生素D结合蛋白GC和PON1;仅在进展期筛选得到的高富集因子包括共激活蛋白(COTL1)、S100A9、S100A8、补体C9等。　　3、分析白癜风不同分期的差异蛋白所表达的四种功能。　　与对照组相比，根据差异倍数＞1.5的标准分析得到:在稳定期和进展期白癜风的差异蛋白所代表的分子功能除了免疫调节和氧化失衡等功能，还包括磷脂酰胆碱结合、丝氨酸蛋白酶抑制剂活化等发挥作用;另外还包括B细胞受体信号通路、吞噬作用、凝集素通路、内源性免疫作用、纤维蛋白溶解负调控等生物过程中的影响;细胞组分如补体和凝血级联成分、IgA免疫球蛋白参与、细胞质Ca2+的反应;还分析发现脂质代谢、Syndecan-4通络、FOXA2转录以及PPAR信号通路的富集作用等。而白癜风的不同分期在分子功能上的区别包括稳定期的低密度脂蛋白结合、蛋白多糖合成和进展期的Toll样受体4结合和花生四烯酸结合;在生物过程中的区别包括稳定期表达的内吞和Fc受体信号通路的吞噬以及进展期的急性期免疫反应;而在通路富集的区别包括稳定期的PPAR信号通路和进展期的amb2整合通路。　　二、白癜风不同分期的差异因子的蛋白水平验证　　1、共同表达下调蛋白LUZP4蛋白水平的验证　　60例样本共分白癜风稳定期、进展期和正常组共3组。　　LUZP4:与正常组比较，差异蛋白下调最明显的LUZP4的蛋白印迹表达结果表明，稳定期和进展期的蛋白表达强度降低与蛋白质组学结果一致。(P＜0.05)　　2、共同表达上调SERPINA5蛋白水平的验证　　60例样本共分白癜风稳定期、进展期和正常组共3组。SERPINA5蛋白的验证结果表明:免疫印迹实验结果显示，SERPINA5在稳定期和进展期的蛋白表达水平均降低，与蛋白质组学结果不一致但差异无统计学意义。进一步对SERPINA5蛋白进行ELISA验证各28例样本共分白癜风稳定期、进展期和30例正常组共3组，3次重复结果。结果表明，与正常组相比，稳定期的SERPINA5的蛋白浓度升高，且差异有统计学意义。(P＜0.05)　　3、脂质相关的差异蛋白验证　　对脂质相关差异蛋白PON1和APOE结果表明:与正常组相比，PON1和APOE在白癜风稳定期和进展期的蛋白印迹反应强度均降低，与蛋白质组学筛查结果一致。且PON1在白癜风进展期的表达水平降低显著，有统计学意义(P＜0.05)。而与正常组相比，APOL1在白癜风的稳定期的蛋白印迹表达强度无明显变化，无统计学意义。经Spearman相关性分析发现，PON1和APOE之间并无相关性。　　三、带状疱疹病毒抗原肽段刺激CTL细胞免疫识别　　1、VZV抗原阳性肽段的筛选　　选择80例进展期白癜风患者中PCR检测HLAA分型排名前三的HLA-A*0301，生物信息学软件预测了VZV抗原的63条肽段。选择12例A0301分型的进展期白癜风患者通过ELISOT方法筛选得到7个阳性肽段，其中有2个强阳性肽段Gp13(FVY-9 Tetramer)和Gp57(HVY-9 Tetramer)。　　2、四聚体的功能学验证　　合成的两个四聚体Gp13和Gp57与CD8+T淋巴细胞通过对HLA-A不同分型的进展期白癜风的检测，得到Gp57的9肽频数范围在HLA-A*0301的进展期白癜风患者中占1％～3.6％之间，与非HLA-A*0301相比频数升高;而激光共聚焦显微镜下观察，两组均可见双标阳性的PBMC，呈非特异性。　　结论：　　1、首次将定量蛋白质组学应用于白癜风不同分期的血清标志物的研究中，与传统蛋白质组学结合，具有较高的准确性。　　2、筛选出的候选标志物鉴定发现LUZP4在白癜风进展期的免疫印迹试验中表达明显下降，提示可能在白癜风的发生发展中起一定作用。　　3、与脂质相关的蛋白PON1和APOE在白癜风的不同分期的蛋白表达均有所降低，提示白癜风的发生发展可能与脂质代谢的关系密切。　　4、病毒感染特别是带状疱疹病毒感染的特殊抗原阳性肽段可能通过刺激CTL细胞的活化，从而发生级联效应杀伤黑色素细胞。