目的:1. 探讨临床鲍曼不动杆菌的耐药性特征及感染特征,多重耐药鲍曼不动杆菌感染的相关危险因素,为临床防控和治疗鲍曼不动杆菌感染提供依据。2.摸索鲍曼不动杆菌生物膜形成实验条件,为进一步探究临床鲍曼不动杆菌生物膜形成能力奠定实验条件基础。3.探讨临床鲍曼不动杆菌生物膜形成能力与耐药能力的关系,为深入理解细菌生物膜感染、耐药机制及感染防控与治疗提供理论基础。4.探讨临床鲍曼不动杆菌耐药能力、生物形成能力、生物膜相关基因和耐药相关基因之间的相互关系,为有效防控细菌的感染与流行、提高清除效率与疗效以及开发新型抗菌药物提供依据。方法:1.收集成都中医药大学附属医院2018年5月-2019年4月临床分离的鲍曼不动杆菌,用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定和药敏分析系统进行菌株鉴定和药物敏感性检测,结果判读按CLSI2019标准;2. 收集临床鲍曼不动杆菌感染者临床信息:年龄、住院科室、住院天数、基础疾病、抗菌素使用情况、接受侵入性操作、合并其他细菌感染等。3. 在微孔内营养肉汤、脑心浸液肉汤、MH肉汤、LB肉汤和TSB肉汤中37℃静置培养鲍曼不动杆菌ATCC19606构建生物膜,分别培养0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h,用结晶紫染色法对各培养基中生物膜形成量进行测定,绘制生物膜生长曲线,激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜。4.用结晶紫染色法和筛选出的实验条件对所有临床鲍曼不动杆菌生物膜量进行测定,判断临床鲍曼不动杆菌菌株的生物膜形成能力。5.用微量肉汤稀释法测定亚胺培南、左氧氟沙星、头孢他啶对临床鲍曼不动杆菌的MIC和MBIC。判断临床鲍曼不动杆菌菌株的耐药能力（耐药率、多重耐药性、MIC、MBIC）。6.对临床鲍曼不动杆菌的耐药相关基因β-内酰胺酶基因(包括ESBLs基因(bla_PER、bla_VEB、bla_CTX-M、bla_TEM、bla_SHV)、bla_{Amp C}基因、碳青霉烯酶基因(A类:bla_KPC、bla_GES、bla_IMI,B类:bla_NDM、bla_VIM、bla_IMP、bla_SPM、bla_GIM、bla_SIM,D类:bla_OXA-23-like、bla_OXA-24-like、bla_OXA-51-like、bla_OXA-58-like)、氨基糖苷类修饰酶基因（aac（3）-Ⅰa、aac（6’）-Ⅰb、aph（3’）-Ⅰa、ant（3’’）-Ⅰa）、16S r RNA甲基化酶基因arm A、喹诺酮类耐药相关基因（gyr A、par C）、外膜孔蛋白基因（car O、omp A）及主动外排泵基因（ade B、ade J、ade G、ade S、ade R、abe M）)和生物膜相关基因（aba I、bap、bfm S、bfm R、csu A、csu AB、csu C、csu D、csu E）进行PCR扩增和扩增产物电泳,产物测序后序列BLAST比对,确定基因型和亚型。结果:1.收集到130株临床鲍曼不动杆菌,非MDR菌株51株（39.2%）,MDR菌株79株（60.8%）,其中XDR菌有21株（16.2%）。临床鲍曼不动杆菌主要来自ICU病人,大多分离自痰液标本。≥60岁的老龄感染者占84%（105/130）。对亚胺培南和头孢吡肟的耐药率最高（61.5%）,对头孢曲松、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率>60%,对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明的耐药率均>50%,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为16.9%,对替加环素中介5株（3.8%）,未检出对替加环素耐药菌株。2.单因素分析结果显示气管切开/插管、尿道置管、入住ICU、住院时间超过30天、使用两联及两联以上抗菌素、使用碳青霉烯类抗菌药物是多重耐药鲍曼不动杆菌感染的危险因素（P<0.05）。多因素logistic回归分析结果显示住院天数超过30天、气管切开/插管是引起多重耐药鲍曼不动杆菌感染的独立危险因素（P<0.05）。3.在5种培养基中鲍曼不动杆菌均能形成生物膜,在不同培养基中生物膜形成量差异明显。鲍曼不动杆菌在LB肉汤和BHI肉汤中生物膜形成量差异无统计学意义（P>0.05）,在MH肉汤、TSB肉汤和NB肉汤中生物膜形成量差异无统计学意义（P>0.05）,在前两种培养基中生物膜形成量显著高于后三种培养基（P<0.05）。在不同的培养时间点,生物膜形成量各异,培养48 h形成的生物膜量显著高于培养36 h形成的生物膜量（P<0.05）,与培养60 h形成的生物膜量差异无统计学意义（P>0.05）。鲍曼不动杆菌在LB肉汤和BHI肉汤中培养48 h的生物膜结构更紧密厚实。4.130株临床鲍曼不动杆菌菌株的生物膜量总体呈正偏态分布。130株临床鲍曼不动杆菌中,生物膜阴性菌株有14株（10.8%）,有116株（89.2%）能形成不同程度的生物膜,其中生物膜弱阳性47株（36.2%）、中阳性51株（39.2%）、强阳性18株（13.8%）。5. 临床鲍曼不动杆菌MDR菌株和XDR菌株生物膜形成能力都以中阳性（43.1%,47.6%）为主,非MDR菌株以弱阳性（37.3%）为主。MDR菌株和XDR菌株的生物膜阳性率显著高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株与XDR菌株之间差异无统计学意义（P>0.05）。MDR菌株和XDR菌株的生物膜形成能力显著强于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株与XDR菌株之间差异无统计学意义（P>0.05）。生物膜阴性菌在MDR菌株和XDR菌株中所占比例显著低于非MDR菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株在非MDR、MDR和XDR菌株中所占比例差异均无统计学意义（P>0.05）。6. 临床鲍曼不动杆菌生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株中非MDR菌株所占比例均显著低于生物膜阴性菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株所占比例无差异（P>0.05）。生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株中非MDR菌株、MDR菌株和XDR菌株构成比无差异（P>0.05）,临床鲍曼不动杆菌生物膜形成量A值与菌株耐抗菌素数目呈正相关（r_s=0.237,P=0.007）。7. 临床鲍曼不动杆菌生物膜阳性菌株对12种临床常用抗菌素的耐药率均显著高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株对11种临床常用抗菌素的耐药率均显著高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,随生物膜形成能力增强（弱阳性、中阳性、强阳性）,临床鲍曼不动杆菌对12种临床常用抗菌素的耐药率上升,但仅对复方新诺明的耐药率上升差异具有统计学意义（P<0.05）。8. 左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对临床鲍曼不动杆菌的MBIC值与MIC值均呈正相关,这三种抗菌素对菌株的MBIC/MIC比值均≥1,其中以2和4为主（>70%）,最高达128。生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株的MIC值均显著高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性、强阳性菌株之间的MIC值无差异（P>0.05）。菌株生物膜形成量A值与左氧氟沙星和亚胺培南对其的MIC值均无相关性,与头孢他啶对其的MIC值呈弱正相关（r_s=0.184,P<0.05）。随着鲍曼不动杆菌生物膜形成能力（弱阳性、中阳性和强阳性）增强,左氧氟沙星和头孢他啶对菌株的MBIC值增加（P<0.05）,生物膜形成量A值与MBIC值呈正相关（LEV:r_s=0.276,P=0.003;TAZ:r_s=0.201,P=0.04）。亚胺培南对生物膜形成能力不同的菌株的MBIC值差异无统计学意义（P>0.05）,生物膜形成量A值与MBIC值没有相关性。随着生物膜形成能力增强,左氧氟沙星和亚胺培南对菌株的MBIC/MIC比值增加（P<0.05）,生物膜形成量A值与MBIC/MIC比值呈正相关（LEV:r_s=0.353,P<0.001;IPM:r_s=0.290,P=0.002）。头孢他啶对生物膜形成能力不同的菌株的MBIC/MIC比值差异无统计学意义（P>0.05）,生物膜形成量A值与MBIC/MIC比值没有相关性。9. 临床鲍曼不动杆菌生物膜相关基因aba I、bap、bfm S、bfm R、csu A、csu AB、csu C、csu D、csu E的检出率分别为81.5%、85.4%、83.8%、98.5%、80.8%、83.8%、90.0%、90.8%、90.0%。生物膜阳性菌株除bfm S外的其余生物膜相关基因检出率均高于生物膜阴性菌株（P<0.05）,生物膜阳性菌株的生物膜相关基因检出数目显著高于阴性菌株（P<0.05）,生物膜弱阳性、中阳性和强阳性菌株之间各生物膜相关基因检出率和检出数目差异均无统计学意义（P>0.05）。10.130株临床鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶基因bla_PER、bla_TEM、bla_NDM、bla_{Amp C}、bla_OXA-23-like、bla_OXA-24-like、bla_OXA-51-like、bla_OXA-58-like检出率分别为3.8%、24.6%、3.1%、87.7%、55.4%、0.8%、80.8%、3.8%,未检出bla_KPC、bla_SHV、bla_GES、bla_VEB、bla IMI、bla CTX-M、bla VIM、bla IMP、bla SPM、bla GIM、bla SIM。bla TEM-1、bla Amp C、bla OXA-23-like和bla_OXA-51-like基因在XDR菌株和MDR菌株中的检出率均显著高于非MDR菌株（P<0.05）,在MDR菌株与XDR菌株间检出率差异无统计学意义（P>0.05）;bla_NDM-1基因阳性菌株均为MDR,头孢他啶对其MIC均>1024μg/m L;bla_TEM-1、bla_{Amp C}、bla_OXA-23-like和bla_OXA-51-like基因阳性菌株对内酰胺类抗菌素的耐药率显著高于阴性菌株（P<0.05）,携带bla_TEM-1或bla_OXA-23-like基因的菌株对头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦和亚胺培南的耐药率达100%;头孢他啶对bla_TEM-1基因阳性菌株的MIC、MBIC值显著高于基因阴性菌株（P<0.05）,MBIC/MIC比值无差异（P>0.05）,对bla_{Amp C}基因阳性菌株与阴性菌株的MIC、MBIC、MBIC/MIC比值无差异（P>0.05）;头孢他啶和亚胺培南对bla_OXA-23基因阳性菌株的MIC和MBIC值显著高于阴性菌株,MBIC/MIC比值均显著低于基因阴性菌株（P<0.05）;头孢他啶和亚胺培南对bla_OXA-51-like基因阳性菌株的MIC值显著高于基因阴性菌株,MBIC/MIC比值均显著低于基因阴性菌株（P<0.05）,MBIC值无差异（P>0.05）。11.临床鲍曼不动杆菌主动外排泵基因ade B、ade G、ade J、ade R、ade S检出率分别为76.9%、68.5%、97.7%、3.8%、73.8%。未检出abe M基因。MDR菌株和XDR菌株的ade B、ade G、ade R、ade S、ade B+ade R+ade S和ade B+ade G+ade J检出率显著高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株之间无差异。ade B、ade G和ade R+ade S基因阳性菌株对13种临床常用抗菌素的耐药率显著高于相应基因阴性菌株（P<0.05）。左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对ade B、ade R+ade S基因阳性菌株的MIC和MBIC显著高于相应基因阴性菌株,左氧氟沙星和亚胺培南对ade B、ade R+ade S基因阳性菌株的MBIC/MIC比值显著低于相应基因阴性菌株（P<0.05）,头孢他啶对ade R+ade S基因阳性菌的MBIC/MIC比值显著低于基因阴性菌株（P<0.05）,头孢他啶对ade B基因阳性和基因阴性菌株的MBIC/MIC比值无差异。左氧氟沙星和亚胺培南对ade G阳性菌株的MIC和MBIC值显著高于基因阴性菌株,左氧氟沙星对ade G阳性菌株的MBIC/MIC比值显著低于基因阴性菌株（P<0.05）,亚胺培南的MBIC/MIC比值无差异。头孢他啶对ade G阳性菌株的MIC、MBIC和MBIC/MIC比值与阴性菌株相比差异均无统计学意义（P>0.05）。12.临床鲍曼不动杆菌氨基糖苷类修饰酶基因aac（3）-Ia、aac（6′）-Ib、ant（3"）-Ia、aph（3′）-Ia和arm A基因检出率分别为3.8%、16.9%、15.4%、43.8%和52.3%。MDR菌株和XDR菌株的aac（6′）-Ib、ant（3"）-Ia、aph（3）-Ia和arm A基因检出率均显著高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株间差异无统计学意义。aac（3）-Ia基因阳性和基因阴性菌株间,对阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素的耐药率无差异（P>0.05）,aac（6’）-Ib、aph（3’）-Ia和arm A基因阳性菌株对阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素的耐药率显著高于相应基因阴性菌株（P<0.05）,ant（3"）-Ia基因阳性菌株对妥布霉素、庆大霉素的耐药率都高于基因阴性菌株（P<0.05）,对阿米卡星的耐药率无差异（P>0.05）。ant+aph+aac基因阳性菌株对庆大霉素和妥布霉素的耐药率显著高于未携带这三种修饰酶基因或携带基因≤2种的菌株（P<0.05）,对阿米卡星的耐药率无差异（P>0.05）。13.临床鲍曼不动杆菌喹诺酮类耐药相关基因gyr A和par C的检出率分别为86.2%和97.7%,gyr A和par C基因的突变率均≥99%,74株菌存在gyr A基因第83位氨基酸Ser→Leu突变,69株菌存在par C基因第80位氨基酸Ser→Leu突变。gyr A基因Ser⁸³→Leu⁸³突变菌株和par C基因Ser⁸⁰→Leu⁸⁰突变菌株对喹诺酮类抗菌素的耐药率均显著高于相应基因未突变菌株（P<0.05）,gyr A基因Ser⁸³→Leu⁸³和par C基因Ser⁸⁰→Leu⁸⁰双位点突变菌株对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均为100%。MDR菌株和XDR菌株的gyr A基因Ser⁸³→Leu⁸³突变、par C基因Ser⁸⁰→Leu⁸⁰突变以及双位点突变检出率均显著高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株之间差异无统计学意义（P>0.05）。左氧氟沙星对gyr A基因Ser⁸³→Leu⁸³突变菌株和par C基因Ser⁸⁰→Leu⁸⁰突变菌株的MIC和MBIC值均显著高于相应基因未突变菌株,MBIC/MIC比值均显著低于相应基因未突变菌株（P<0.05）。14.临床鲍曼不动杆菌外膜孔蛋白基因omp A和car O检出率分别为100%和70.8%。MDR菌株和XDR菌株的car O基因检出率显著高于非MDR菌株（P<0.05）,MDR菌株和XDR菌株间差异无统计学意义;car O基因阳性菌株对13种临床常用抗菌素的耐药率显著高于car O基因阴性菌株（P<0.05）;左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对car O基因阳性菌株的MIC、MBIC值显著高于car O基因阴性菌株（P<0.05）,MBIC/MIC比值显著低于car O基因阴性菌株（P<0.05）。15.临床鲍曼不动杆菌XDR菌株和MDR菌株生物膜相关基因aba I、bap、bfm S、csu A、csu AB和csu E检出率均显著高于非MDR菌株（P<0.05）,XDR菌株csu C和csu D的检出率均显著高于非MDR菌株（P<0.05）,XDR菌株与MDR菌株间差异无统计学意义。aba I阳性菌株和csu A阳性菌株对这13种常用抗菌素的耐药率均显著高于相应基因阴性菌株,bap阳性菌株、bfm S阳性菌株、csu AB阳性菌株和csu C+csu D+csu E阳性菌株对除头孢哌酮/舒巴坦外的12种常用抗菌素的耐药率均显著高于相应基因阴性菌。左氧氟沙星、头孢他啶和亚胺培南对生物膜相关基因阳性菌株的MIC和MBIC值几乎都显著高于生物膜相关基因阴性菌株,MBIC/MIC比值显著低于生物膜相关基因阴性菌株或无差异。16.临床鲍曼不动杆菌耐药相关基因bla_TEM、bla_OXA-23、ade B、arm A、aph（3’）-Ⅰa和gyr A-ser→leu⁸⁰阳性菌株的生物膜形成能力显著强于相应基因阴性菌株（P<0.05）。在130株临床鲍曼不动杆菌中,随着生物膜形成能力增强,bla_OXA-23、arm A、aph（3’）-Ⅰa和gyr A-ser→leu⁸⁰基因的检出率显著升高（P<0.05）。在79株多重耐药鲍曼不动杆菌中aph（3′）-Ⅰa基因的检出率随生物膜形成能力增强而升高,在生物膜中阳性和强阳性菌株中aph（3’）-Ⅰa基因的检出率显著高于生物膜弱阳性和阴性菌株（P<0.05）。结论:1.鲍曼不动杆菌耐药情况严重,住院天数超过30天、气管切开/插管是引起MDR-AB感染的独立危险因素。2.鲍曼不动杆菌ATCC19606在LB肉汤培养基中37℃微孔内培养48h形成的生物膜量最大,可作为临床鲍曼不动杆菌生物膜形成能力测定的实验条件。3.绝大多数临床鲍曼不动杆菌都能形成生物膜,鲍曼不动杆菌生物膜问题值得重视。同一菌株的生物膜态菌比浮游态菌的耐药能力更强。4.多重耐药鲍曼不动杆菌的生物膜形成能力更强,生物膜阳性鲍曼不动杆菌耐药能力（多重耐药性、耐药率、MIC、MBIC、MBIC/MIC比值）比生物膜阴性菌株强,生物膜形成能力强弱与耐药能力（耐抗菌素数目、对复方新诺明耐药率、MBIC、MBIC/MIC比值）强弱呈正相关。头孢哌酮/舒巴坦是治疗生物膜阳性鲍曼不动杆菌感染的有效药物。5.生物膜相关基因aba I、bap、bfm S、csu A、csu AB、csu C、csu D和csu E与鲍曼不动杆菌生物膜形成密切相关,但与细菌生物膜形成能力强弱无关。aba I、bap、bfm S、csu A、csu AB、csu C+csu D+csu E基因与鲍曼不动杆菌耐药能力（耐药率、MIC和MBIC）强弱呈正相关,与多重耐药性相关,但与多重耐药性能力强弱无关。6.耐药相关基因bla_TEM-1、bla_{Amp C}、bla_OXA-23-like、bla_OXA-51-like、bla_NDM-1、ade B、ade G、ade R、ade S、aac（6’）-Ib、ant（3"）-Ia、aph（3’）-Ia、arm A、car O、gyr A-Ser⁸³→Leu⁸³突变和par C-Ser⁸⁰→Leu⁸⁰突变与鲍曼不动杆菌的耐药能力（耐药率、MIC和MBIC）呈正相关,与菌株的多重耐药性有关,但与多重耐药能力强弱无关。bla_OXA-23、arm A、aph（3’）-Ⅰa、gyr A-ser→leu⁸⁰与鲍曼不动杆菌生物膜形成能力呈正相关,aph（3’）-Ⅰa与生物膜形成能力正相关性强。