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2010年4月,坦布苏病毒病在我国东南沿海地区（浙江、福建等地）爆发,之后迅速在我国养鸭场蔓延流行,感染后可引起产蛋鸭产蛋下降和雏鸭的神经症状,给我国养鸭业造成巨大经济损失。该病病原为坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）,是黄病毒属成员之一。同属黄病毒有乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、西尼罗河病毒（West Nile Virus,WNV）、登革病毒（Dengue virus,DENV）和寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）等。研究表明,多种黄病毒的NS5蛋白可以拮抗JAK-STAT信号转导来对抗宿主IFN-Ⅰ反应,以此逃避天然免疫反应。本实验室前期研究表明,TMUV-NS5利用37～45 aa与核转运蛋白（KPNA1）互作,拮抗JAK-STAT信号转导,同时核定位信号（NLS）在病毒复制、病毒蛋白功能的发挥等方面具有关键作用。在此基础上,本研究对TMUV-NS5的NLS37~45进行筛选鉴定,同时对其相关功能和作用机制进行深入探究,研究内容包括以下几个方面:1.TMUV-NS5-NLS37~45鉴定及TMUV-NS5亚细胞定位分析实验室前期研究证实TMUV-NS5-NLS37~45具有核定位功能,并且可与KPNA1互作拮抗JAK-STAT。为进一步验证该序列的生物学活性,本研究构建NLS与2×GFP的串联表达质粒,IFA结果显示NLS37~45可以携带2×GFP进入细胞核,Co-IP也显示NLS37~45-2×GFP与KPNA1存在相互作用,从而证实了NLS37~45的生物学活性。此外,本研究将NLS37~45连接到TMUV-NS5-Rd Rp结构域,细胞定位结果显示NLS37~45可以将原本定位在细胞质中的Rd Rp结构域带入细胞核,进一步说明了前期结果的准确性。同时根据氨基酸相似性分析,TMUV-NS5的37～45位氨基酸在TMUV中高度保守。NLS中的碱性氨基酸对其发挥活性至关重要。为确定37～45 aa中发挥功能的碱性氨基酸,本研究将NLS37~45中的碱性氨基酸进行单点突变,构建包含NLS37~45与2个GFP蛋白的一系列突变体表达质粒。IFA结果显示,除野生型NLS37~45-2×GFP可以完全定位在细胞核,其它突变体均呈现出非完全核定位。为验证上述结果的准确性,将突变体质粒与Myc-KPNA1共转染HEK293细胞,Co-IP显示,与NLS37~45-2×GFP共转组相比,其它突变体与KPNA1的互作能力均明显减弱。以上结果证实,TMUV-NS5-NLS37~45中每个碱性氨基酸均发挥功能性作用。在确定NLS37~45具有生物活性后,为确定其能否将TMUV-NS5定位在细胞核,本研究进行了后续鉴定。本研究在Hela细胞中过表达HA-NS5,对TMUV-NS5蛋白的亚细胞定位进行分析,激光共聚焦结果显示TMUV-NS5定位在细胞质中,并且不受IFN-α刺激时间的影响;出核抑制剂LMB的使用也未将NS5蛋白集中在细胞核,该结果充分说明TMUV-NS5蛋白的亚细胞定位是在细胞质中。尽管本研究确定了NLS37~45的核定位活性,却未发现TMUV-NS5的细胞核定位,推测蛋白的细胞核定位与多种因素密切相关。2.NLS37~45核定位能力分析本研究分别构建能够串联表达NLS37~45与2、3、4个GFP蛋白的表达质粒(NLS37~45-2×GFP、NLS37~45-3×GFP、NLS37~45-4×GFP),以模拟不同分子量的货物蛋白。转染Hela细胞并结合激光共聚焦分析其细胞定位,结果显示当蛋白质分子量较小时,NLS37~45可以携带蛋白质（2×GFP、3×GFP）入核,呈现出完全核定位;当分子量增加到一定大小时（4×GFP）,则不能完全核定位,呈现出弥散分布。该结果说明NLS37~45的核定位能力与货物蛋白的分子量大小有关。为进一步验证上述结果,本研究对NS5蛋白进行相应截短,并鉴定各截短体的细胞定位。结果显示包含NLS37~45的截短体可以核定位,而不含NLS37~45的区域则定位于细胞质中;并且NLS37~45-Rd Rp完全核定位,TMUV-NS5包含NLS37~45只定位在细胞质中。本研究将黄病毒属中已确定具有核定位各自NS5蛋白的NLS等位替换到TMUV-NS5蛋白中,并观察这种替换是否影响TMUV-NS5的细胞定位。结果显示,突变体TMUV-NS5仍定位在细胞质中,该现象说明不限于货物蛋白的分子质量,NLS37~45的定位能力还与蛋白分子结构有关,不同类型的货物蛋白同样影响NLS功能发挥。3.黄病毒属病毒NLS37~45同等区域比较分析经过以上分析,本研究证实TMUV-NS5-NLS37~45具有典型的NLS功能,为进一步分析黄病毒属成员此段区域是否具有相同功能,选取五种典型的黄病毒,对同等区域的氨基酸序列进行相似性分析。结果显示,NLS37~45序列相对比较保守,TMUV与WNV、JEV仅有1个碱性氨基酸种类的差别,ZIKV、YFV和DENV-2与TMUV-NS5-NLS37~45相似性较低。随后,本研究将全部序列与2×GFP连接,分析不同黄病毒37～45 aa（或38～46 aa）区域是否同TMUV-NS5-NLS37~45一样具有核定位活性。激光共聚焦结果显示,其它黄病毒的该区域并不能将2×GFP完全定位于细胞核中,从而说明NLS37~45在TMUV中具有活性的特异性。将黄病毒同等区域中相应位置的碱性氨基酸突变为与TMUV-NS5-NLS37~45相同的碱性氨基酸结构,转染后,细胞定位结果显示,突变后的序列可携带2×GFP完全定位在细胞核中,说明该序列在突变后具备了核定位能力。此外,Co-IP结果也显示突变后的序列与KPNA1发生相互作用。这提示若其它黄病毒发生上述突变,可能使它们的NS5蛋白对JAK-STAT信号通路抑制作用增强,进一步拮抗天然免疫反应。综上,本研究成功鉴定TMUV-NS5的核定位信号(NLS37~45),并对其核定位能力进行探究,明确了TMUV-NS5-NLS37~45的核定位能力与货物蛋白的分子量大小和结构密切相关,同时揭示其它黄病毒若发生此类突变的风险性。