【摘 要】
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萱草是我国栽培历史悠久的观赏花卉之一,隶属于阿福花科萱草属。单子叶植物萱草有着和禾本科植物相似的分蘖方式,分蘖是关于萱草产量以及观赏性的重要性状。禾本科植物分蘖是一个复杂的生物学现象,该过程受到多种激素的协同调节,研究发现独脚金内酯（Strigolactones,SLs）在植物分蘖中起着重要的作用,其作用表现为对芽的抑制。在水稻中,分蘖芽的生长调控受到独脚金内酯Max/RMS/D途径的调控,该途径
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萱草是我国栽培历史悠久的观赏花卉之一,隶属于阿福花科萱草属。单子叶植物萱草有着和禾本科植物相似的分蘖方式,分蘖是关于萱草产量以及观赏性的重要性状。禾本科植物分蘖是一个复杂的生物学现象,该过程受到多种激素的协同调节,研究发现独脚金内酯（Strigolactones,SLs）在植物分蘖中起着重要的作用,其作用表现为对芽的抑制。在水稻中,分蘖芽的生长调控受到独脚金内酯Max/RMS/D途径的调控,该途径在高等植物中可能是保守的。DWARF14（D14）是独脚金内酯信号传导途径的关键基因,起到水解SLs和感知SLs活性分子的作用,在植物分蘖中具有重要意义。在独脚金合成路径上,DWARF27（D27）编码首个β-胡萝卜素顺式/反式异构酶,出现在独脚金内酯生物合成的第一步。本研究以萱草低分蘖品种‘秋红’以及多分蘖品种‘M-1’、‘M-2’、‘M-3’、‘金娃娃’为研究对象,对萱草独脚金内酯合成基因HfD27、受体水解酶基因HfD14进行功能探究,为萱草的分蘖以及株型调控提供新思路。主要内容如下:（1）在本实验室萱草‘秋红’转录组数据选出萱草D14候选基因HfD14,并经过克隆验证。生物信息学分析结果显示HfD14蛋白质是疏水性蛋白质,属于α/β水解酶超家族。并根据水稻Os D14蛋白的结构预测出了HfD14蛋白形成受体口袋以及水解酶三联体的关键区域,α4-α7螺旋区(R143HfD14-T155HfD14、Y157HfD14-V169HfD14、P174HfD14-N186HfD14、P189HfD14-F200HfD14)。通过克隆本实验室筛选三种高分蘖力萱草材料M-1、M-2、M-3以及低分蘖力萱草‘秋红’D14基因,并进行生物信息学对比分析。萱草四种D14在疏水性上都存在差异,但都属于疏水性蛋白质。基本理化性质预测显示四种D14蛋白的等电点也存在差异,这可能导致蛋白质的结构存在差异。序列对比显示,与HfD14相比M-3第199位氨基酸(对应V194At D14)的差异位于D14蛋白α4-α7螺旋区,这可能影响D14与独脚金内酯分子的结合。而D52At D14(对应D57HfD14)是At D14与D3蛋白互作过程的关键基因,M-2第57位的氨基酸可能影响D14与D3蛋白互作。（2）在本实验室萱草‘秋红’转录组数据选出萱草D27候选基因HfD27。HfD27蛋白的保守功能域分析结果显示其第155位到第23位氨基酸属于DUF4033超基因家族。用PCR技术,在萱草‘秋红’、多分蘖品种‘金娃娃’中首次克隆得到HfD27基因的CDS全长。序列对比发现二者具有相同的保守功能域,这可能表明二者的功能差异不大。（3）为了探究萱草HfD14、HfD27的表达模式,对两个基因进行亚细胞定位观察,结果显示HfD14定位在细胞质和细胞核中,HfD27定位于叶绿体中。以萱草‘秋红’不同组织部位为材料,用荧光定量PCR技术分析HfD14、HfD27组织特异性表达情况,荧光定量PCR表明HfD14、HfD27均在萱草腋芽的表达量最高,这说明这两个基因可能与萱草分蘖密切相关。（4）为进一步验证萱草HfD14、HfD27的功能,构建了植物表达载体1301-ubq10-HfD14-Flag、1301-ubq10-HfD27-Flag。在野生型拟南芥、拟南芥d14突变体中分别转入表达载体1301-ubq10-HfD14-Flag进行HfD14过量表达以及功能互补实验,在野生型拟南芥中对HfD27进行过表达。其中过表达用农杆菌侵染法侵染野生型拟南芥,利用抗性以及PCR筛选获得了T0代转基因植株。后续分子与表型鉴定还有待进一步的研究。
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