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目的:过氧化氢(H2O2)作为机体内主要的氧化反应的代谢产物可以自由穿过细胞膜,并作为一种信息传递分子在血管内起作用。目前H2O2对血管作用的体外研究大多数局限于探讨它的瞬时影响,而它的长效作用则报道较少。我们的前期实验表明mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素(rapamycin,rapa)可以保护H2O2长效处理造成的不可逆收缩功能的丧失,而其机理尚不明确,同时有文献报道H2O2可以激活mTOR信号通路,因此,我们拟对H2O2对血管收缩功能的影响与mTOR通路的关系进行研究,同时探讨H2O2对血管收缩功能影响的潜在作用机制。
方法:通过肌电描记器系统(Myograph)记录各种不同药物对H2O2长效处理所造成的血管收缩功能丧失作用的影响,同时采用蛋白免疫印记法(westernblot)对各种药物处理后组织中40s核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)的磷酸化水平和肌球蛋白轻链(MLC20)的磷酸化水平进行检测,并且采用ENZO公司的钙调神经磷酸酶活性测定试剂盒对钙调神经磷酸酶(Calcineurin,PP2B,CaN)的活性进行检测。
结果:
1.rapa(20μM)可以保护H2O2(200μM)处理3 h造成的不可逆收缩功能的丧失(rapa+H2O2:55.5±11.7%(50 mM KCl),65.3±24.1%(1μM PE)VS H2O2:13.9±4.8%(50μM KCl),10.44±2.8%(1μM PE),p<0.05,n=4);
2.H2O2(200μM)处理3 h没有使p70s6k的磷酸化水平发生变化(H2O2:96.8±36.2%VS空白:100%,p>0.05,n=3);
3.H2O2(200μM)处理3 h使MLC的磷酸化水平发生变化,同时rapa对这种变化产生了影响(空白:100%;H2O2:12.44±0.9%;rapa+H2O2:39.7±8.4%,P<0.05,n=3);
4.H2O2(200μM)处理3 h使PP2B的活性发生了变化,同时环孢素A(CiclosporinA,CsA)与rapa均对这种变化产生了影响(空白:0.256±0.052;H2O2:0.402±0.059;rapa+H2O2:0.226±0.074;CsA+H2O2:0.131±0.026,p<0.05,n=3)
结论:
1)在H2O2造成的血管收缩功能丧失过程中,rapa能起到一定的保护作用,并且这种保护作用与H2O2的浓度和处理时间有关,但rapa并不能逆转H2O2造成的血管收缩功能的丧失。
2)H2O2并没有激活mTOR-S6K通路,而rapa对H2O2造成血管收缩功能丧失的保护作用也不是通过mTOR-S6K信号通路。
3)CsA和FK506均和mpa一样,对于H2O2造成的血管收缩功能丧失具有一定的保护作用。
4)钙调神经磷酸酶参与了H2O2引起的血管收缩功能丧失的过程。