超声辅助离子液体提取卷柏和银杏叶中双黄酮及其抗氧化活性研究

来源 :遵义医科大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:pjq521
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目的:卷柏和银杏叶均是传统中药,含多种生物活性成分如双黄酮类、酚酸类等。双黄酮类化合物是其主要有效成分之一,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等作用。基于此,本课题建立同时测定卷柏和银杏叶中主要双黄酮的含量分析方法,为其提取工艺研究奠定基础;首次采用绿色溶剂离子液体提取两种植物中主要双黄酮,并优化提取工艺;探究两种提取物的抗氧化活性,为更好的开发利用卷柏和银杏叶提供依据。方法:1.建立高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测卷柏中穗花杉双黄酮(Amentoflavone,AME)和扁柏双黄酮(Hinokiflavone,HIN)以及银杏叶中白果双黄酮(Bilobetin,BIL)、银杏双黄酮(Ginkgetin,GIN)、异银杏双黄酮(Isoginkgetin,IGIN)和金松双黄酮(Sciadopitysin,SCI)含量的方法。2.选用苯并噁唑和6种不同类型的酸或酸性盐为原料,采用一步法合成6种离子液体,通过元素分析、红外光谱分析和核磁共振对合成的离子液体进行结构表征,并通过热重分析评价离子液体的热稳定性。3.探索离子液体结合超声提取卷柏中AME和HIN及银杏叶中BIL、GIN、IGIN和SCI的最佳提取工艺,首先同时考察6种苯并噁唑类、吡啶类及5种咪唑类离子液体对卷柏和银杏叶中主要双黄酮提取率的影响,筛选出提取效果最佳的离子液体;然后通过单因素实验对离子液体浓度、固液比、超声功率、超声时间和提取次数进行优化,筛选出对双黄酮提取率影响显著的几个因素,进一步做响应面分析;在单因素实验的基础上,采用响应面法Box-Behnken design(BBD)设计实验方案,优化对提取工艺影响显著的因素,使双黄酮提取率达到最大值,并与传统的提取方法进行比较以及探索离子液体的回收利用效果。4.以最佳提取工艺得到的卷柏和银杏叶提取物为考察对象,采用4种不同的抗氧化方法(清除DPPH·法、清除ABTS·法、金属离子螯合法和铁离子还原法)评价其体外抗氧化活性。结果:1.从卷柏和银杏叶提取物的色谱图可知,主要双黄酮的色谱峰均达到基线分离,且保留时间与对照品基本一致;AME、HIN、BIL、GIN、IGIN和SCI标准品分别在0.0410.244 mg/mL、0.0400.243 mg/mL、0.0400.239 mg/mL、0.0410.245mg/mL、0.0410.245 mg/mL、0.0410.247 mg/mL范围内,质量浓度与峰面积的线性关系良好,R2均大于0.999;方法学考察实验结果的RSD值均小于2.0%,平均回收率分别为:97.15%、97.73%、97.52%、97.17%、98.33%,说明该分析方法适用于测定卷柏和银杏叶中主要双黄酮含量。2.首次合成了6种苯并噁唑类离子液体:苯并噁唑甲烷磺酸盐([HBox]CH3SO3)、苯并噁唑三氟甲烷磺酸盐([HBox]CF3SO3)、苯并噁唑对甲苯磺酸盐([HBox]p-Ts)、苯并噁唑六氟磷酸盐([HBox]PF6)、苯并噁唑溴盐([HBox]Br)和苯并噁唑三氟乙酸盐([HBox]CF3COOH);并用热重分析评价6种离子液体的热稳定性,发现离子液体的热稳定性可能与苯并噁唑环无关,而是与阴离子的种类相关,其热稳定的大小顺序为:p-Ts->CHSO3->CF3HSO3->PF6->Br->CH3COO-。3.优化超声辅助离子液体提取卷柏和银杏叶中主要双黄酮的分析条件,首先筛选出提取效果最佳的离子液体,卷柏为N-丁基吡啶四氟硼酸盐([Bpy]BF4),银杏叶为N-乙基吡啶四氟硼酸盐([Epy]BF4);通过单因素实验和响应面分析确定了各影响因素的最佳水平,卷柏中2种双黄酮最佳提取条件:离子液体浓度为0.15 mol/L,固液比为1:12 g/mL,超声功率为280 W,超声时间为30 min,提取次数为3次。银杏叶中4种双黄酮最佳提取条件:离子液体浓度为0.15 mol/L,固液比为1:14 g/mL,超声功率为280 W,超声时间为25 min,提取次数为3次;其中卷柏中AME提取率为13.51mg/g和HIN提取率为6.74 mg/g;银杏叶中BIL提取率为2.44 mg/g,GIN提取率为4.33 mg/g,IGIN提取率为6.50 mg/g和SCI提取率为13.97 mg/g;离子液体和双黄酮的回收试验结果可知回收的离子液体可重复6次提取双黄酮,且其提取率仍在90%左右,表明离子液体能有效地回收与再利用。4.运用4种抗氧化方法,考察了卷柏和银杏叶提取物的抗氧化活性。其中,卷柏和银杏叶提取物清除DPPH自由基的IC50值分别为39.95μg/mL、35.05μg/mL,最大清除率分别为88.435%、88.53%;清除ABTS自由基的IC50值为45.59μg/mL、46.18μg/mL,最大清除率分别为95.71%、91.29%;卷柏和银杏叶提取物对铁离子还原能力的最大吸光度分别为1.757、1.653,EC50值分别为50.39μg/mL、46.35μg/mL;金属离子螯合率分别为94.49%、97.54%。结果表明两种提取物均具有一定的自由基清除、金属离子螯合和还原能力。结论:本研究建立了卷柏和银杏叶中主要双黄酮的含量检测方法;合成了6种苯并噁唑类离子液体,并证明了离子液体具有较好的热稳定性;通过单因素实验和响应面法优化了超声辅助离子液体提取卷柏和银杏叶中主要双黄酮的工艺,得到了最佳提取条件以及离子液体可回收再利用;抗氧化实验表明卷柏和银杏叶提取物具有一定的抗氧化活性。
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