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在体细胞克隆中,卵母细胞质中的重编程因子需将供体细胞核原有的表观修饰标记清除并重编程为有利于胚胎发育的状态,重构胚胎才能发育成为新的个体。组蛋白H3K9三甲基化修饰(H3K9me3)重编程不完全是导致体细胞克隆胚胎发育阻滞的主要原因之一。过表达去甲基化酶4A(histone demethylases 4A,KDM4A)下调供体细胞的 H3K9me3 修饰水平,可以显著提高克隆胚胎的发育率。近年来,多个研究团队发现在供体细胞培养液或克隆胚胎培养液中添加维生素C均可以提高体细胞克隆胚胎的发育率,但其中具体的作用机制不清楚。维生素C(Vitamin C,Vc)是Fe 2+/α-酮戊二酸依赖性氧化加氧酶的辅助因子,KDM4属于该家族酶类,基于此推测,维生素C可能通过调控KDM4A表达影响H3K9me3的修饰水平。因此,本试验拟探究Vc对水牛胎儿成纤维细胞(Buffalo fetal fibroblasts,BFFs)的增殖、代谢、表观遗传修饰等生物学特性的影响,重点探讨Vc对KDM4A表达的影响及其调控的分子机制。研究取得以下结果:1.Vc对BFFs增殖、代谢、表观遗传修饰等的影响使用20 μg/mL Vc培养处理BFFs 48 h,可以促进细胞增殖速度及增殖相关基因的表达(P<0.05);降低细胞凋亡率及凋亡相关基因的表达(P<0.05)。添加20 μg/mL Vc时,细胞内ATP产量开始下降,添加30 μg/mL Vc时,细胞内ATP含量显著降低(P<0.05),细胞代谢表型向糖酵解方向漂移。随着处理浓度的增加,Vc可以显著降低组蛋白H3K9me3修饰水平(P<0.05),显著提高组蛋白H3K9ac修饰水平(P<0.05),显著降低HP1α的表达(P<0.05)。Vc还可以使细胞核内的异染色质变少,染色质的可及性增加。2.Vc通过调控KDM4A表达影响BFFs凋亡、H3K9me3修饰及HP1α表达Vc可以显著上调KDM4A,KDM4B,KDM4C,KDM4D的表达。使用0.25 μM Toxoflavin(KDM4A抑制剂)抑制KDM4A的表达会显著提高细胞凋亡率(P<0.05),显著提高H3K9me3修饰水平和上调HP1α的表达(P<0.05);抑制KDM4A表达的同时,添加20 μg/mL Vc可以降低细胞凋亡,同时显著降低H3K9me3的修饰水平及HP1α表达水平(P<0.05)。3.Vc主要通过PI3K信号通路影响KDM4A表达PI3K、MEK/MAPK和mTOR这三条通路均会影响KDM4A的表达,但PI3K信号通路对KDM4A影响最大。使用10μg/mL LY294002(PI3K抑制剂),0.25 nM Rapamycin(mTOR 抑制剂),1.25 μMPD98059(MEK 抑制剂分别抑制PI3K、mTOR、MEK的表达,均可以显著降低KDM4A的表达(P<0.05);添加20 μg/mL Vc可以通过挽救LY294002对PI3K的抑制作用,显著提高KDM4A的表达(P<0.05);但添加20 μg/mL Vc不能挽救抑制剂对mTOR或MEK的抑制,不能显著提高KDM4A的表达(P>0.05)。4.Vc通过PI3K/PDK1/SGK1信号轴影响KDM4A的表达Vc通过PI3K/PDK1/SGK1信号通路调控在BFFs中的KDM4A的表达,降低H3K9me3修饰水平及HP1α的表达。20 μg/mL Vc可以显著上调PI3K、PDK1、SGK1基因表达的上调。使用250nM MP7(PDK1抑制剂)抑制PDK1的表达或者使用3 μM EMD(SGK1抑制剂)抑制SGK1表达均会显著下调KDM4A的表达、提高H3K9me3修饰水平及HP1α的表达水平(P<0.05);如果同时添加20 μg/mL Vc,则可以挽救KDM4A表达的下调、降低H3K9me3修饰水平及HP1α的上调(P<0.05)。上述研究结果表明:Vc可以调控细胞的增殖、代谢和表观遗传修饰等特性;提示Vc可以使供体细胞的表观遗传修饰水平向更容易被重编程的状态转变,后续将进一步加以验证。这些工作为提高体细胞重编程效率提供了理论依据和实验基础。