研究背景： 氯离子通道在细胞兴奋性调节，跨上皮物质转运，细胞容积调节，细胞器酸化作用中发挥重要的作用，甚至在细胞免疫应答，细胞迁移，细胞增殖和分化等过程中也有一定作用。这种功能的多样性对应于不同种类的氯离子通道，而且这些通道由多种完全不同的基因编码。电压门控氯离子通道（ClC）是其中的一类，而且ClC基因分布广泛，存在于动物、植物、酵母和细菌中。目前从哺乳动物细胞中已经克隆得到了九种不同的ClC通道。ClC通道的功能缺失或改变与人类的某些遗传性疾病有密切的关系，如先天性肌强直，肾结石，Bartter’s综合征。ClC-1氯离子通道（ClC-1）是第一个从哺乳动物中克隆得到的ClC通道，其主要表达于骨骼肌，但在心脏、肾脏和平滑肌中也有少 第四军医大学博士论文 量表达。目前的研究结果表明，CIC－1 与先天性肌强直疾病关 系密切。 CIC＊作为哺乳动物中第一个发现的趴 通道，近十年来 一直作为重点的研究对象。但由于其最早克隆于骨骼肌，而且 CIC、基因突变导致的通道功能丧失或通道电导减小会引起肌 强直，因此，几乎所有的研究都是围绕通道的结构、功能与疾病 之间的关系展开的，目前己经取得了大量的研究结果。但是， CIC八 的结构与功能的关系、电压门控机理、阻断特性等重要 问题仍没有得到清晰的结论。特别是对皿－1是否存在不同剪 接方式的通道亚型没有任何的研究报道。除Steinmeyer等＊） 克隆0－1的报道外，对除骨骼肌外CIC－1的组织分布特征没 有开展进一步的研究工作。这就妨碍了对O－1结构复杂性和 功能多样性的认识。由于＊ 通道多个成员存在组织分布的广 泛性、基因编码和氨基酸序列的相似性，而且仁七，CIC七， C！C－6和0－KZ等多个成员存在不同剪接方式的通道亚型，有 理由推测CIC刁也很可能存在不同剪接方式的通道亚型，并分 布于除骨骼肌外的非兴奋性细胞或其他兴奋细胞。 由于汉高子通道在C6神经胶质瘤细胞的功能活动调节中发 挥重要作用，而且胶质细胞氯离子通道和神经元受体氯离子通 邀间存在相互作用关系，因此，需要对C6细胞中存在的氯离子 通道进行深人研究。但是，目前除在C6细胞上记录到容积敏感 性氯离子通道外，还存在其他哪些氰离子通道仍不清楚，因而有 必要研究C6细胞中CIC通道的表达和作用。另外，有些研究结 果报道包括CIC－1在内的多个0 通道表达于心脏，本文开展 4 第四军医大学博士论文 CIC、的研究有助于认识心脏中仁 通道的作用。 研究目的： 将分子生物学技术和电生理学方法有效地结合，对CIC－1 在基因和功能两个水平进行研究。具体包括：从C6细胞中克隆 大鼠O－1的多个通道亚型的CDNA序列，揭示m－1基因转录 的某种调节机理；在非洲爪焰卵母细胞上异源性表达通道亚型 基因并记录各通道的电流，分析其通道电流特性，揭示Q－l的 结构与功能的关系；在非洲爪蛔卵母细胞上异源性表达大鼠野 主型（WT）C IC＊ 并记录电流，研究其电生理特性；在非洲爪媚 卵母细胞上共同表达通道亚型和野生型基因并记录电流，分析 其电流特征，判断通道亚型与大鼠们 CIC八间是否产生互相影 响；建立＊d 门控的模型；初步分析星形胶质细胞瘤中氯离 子通道作用的分子学机制；基于通道电流长时间记录的需要， 本文拟开发一种替代热敏或描笔记录仪的适宜于长时间离子通 道电流记录的软件。 研究内容和方法： 采用的方法和具体研究内容包括：C6细胞的培养；采用 RT－PCR法，cDNA 3’端快速扩增法和。DNA 5’端快速扩增法，从 C6细胞上克隆大鼠CIC－1的通道亚型的。DNA，测序并连接到质 粒载体中。对比分析大鼠WT CIC－1基因的核昔酸序列特征和亚 型基因的剪接方式，探讨CI卜1基因转录的调节机理：体外转 录得到通道亚型和野生型基因的mRNA，以纳升为单位注射到非 5