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慢性应激可以引起机体神经精神系统功能失调,导致衰老过程加速、学习记忆障碍、阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)、抑郁等神经退行性疾患。多种神经系统退行性疾病中都出现了细胞骨架的异常。其中许多疾病出现了tau蛋白相关的病理改变,如AD中的神经原纤维缠结,提示慢性应激与tau蛋白异常之间存在相关性。异常磷酸化的tau蛋白不仅不能与微管蛋白结合,同时也使另外两种微管相关蛋白(Microtubule-associated proteins, MAPs)MAP1A/MAP1B和MAP2与微管分离,导致微管解聚。Tau分子的异常通过何种机理来导致AD等神经退行性疾病的神经退行性病变是一个关键的问题,是异常磷酸化引起正常活性丧失?还是不溶性NFT的形成?这对于神经退行性疾病的预防和治疗具有十分重要的意义,也成为了神经科学领域的研究热点之一。为了研究异常tau分子的致病机理及其与MAP2异常的关系,我们采用慢性束缚应激模型来模拟慢性应激状态,用重组缓冲液(Reassembly buffer, RAB)、RIPA缓冲液、和70%的甲酸(Formic acid, FA)分步提取脑组织蛋白。根据报道,RAB组分提取到的为可溶性异常磷酸化tau蛋白,RIPA缓冲液提取到的是可聚集为双股螺旋细丝(Paired helical filaments, PHFs)PHF-tau,而FA提取的是聚集成神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)的成分。本研究用western blot的方法检测慢性束缚应激引起tau蛋白磷酸化和MAP2丢失的特点；并制备冰冻切片,随后用免疫组组织化学、免疫荧光的方法检测了异常磷酸化tau蛋白和MAP2的分布改变情况。主要研究结果如下：1.慢性束缚应激诱导的tau蛋白磷酸化水平及形式给予动物每天1小时,连续14天的慢性束缚应激后,用两种分别识别不同tau蛋白磷酸化位点的抗体进行western blot分析,观察到可溶性磷酸化tau蛋白组分显著增多,而不可溶性磷酸化tau蛋白含量没有明显改变,FA组分中未检测到磷酸化tau蛋白条带,但检测到ATP合酶α亚单位。给予动物每天6小时,连续21天的慢性束缚应激后,进行western blot分析,结果显示可溶性磷酸化tau蛋白含量无明显变化,但不可溶性磷酸化tau蛋白含量显著增多。并在增加加样量的情况下海马FA组分中检测到磷酸化tau蛋白。我们同时检测了β-淀粉样蛋白前体蛋白APP的变化情况,结果显示,应激后,高分子量APP显著减少,而相对低分子量的APP则增加,这种变化在加重应激刺激的情况下更为显著。以上结果提示,慢性束缚应激可增加脑内tau蛋白的磷酸化,不同强度的应激刺激强度可导致磷酸化tau蛋白在不同蛋白组分中的分布差异。强的应激刺激使不溶性的磷酸化tau增加。2.慢性束缚应激诱导的磷酸化tau蛋白和MAP2的形态和分布改变免疫组织化学检测每天应激1h,连续应激14天的动物脑片,结果显示磷酸化tau蛋白在皮层、海马、丘脑和梨状皮层都有明显增加。其中大脑新皮层和海马中磷酸化tau增加明显,而杏仁核这一与情感应激紧密相关的结构呈弱阳性增加；另外,正常情况下tau蛋白主要位于神经元胞体和轴突,但是在应激刺激后磷酸化tau蛋白在皮层主要分布在胞体和树突。对于另一种微管关联蛋白MAP2的染色分析显示MAP2在树突分布明显减少,同时免疫印迹也显示MAP2表达减少；在皮层和CA3区,可见长而粗的树突突起内有串珠状退行性变结构,而较短的树突突起内有颗粒空泡状退行性变结构。免疫荧光双标结果显示,异常磷酸化tau蛋白的增多的神经元有MAP2在神经突起中的分布减少,提示在慢性应激刺激后二者在脑内的变化存在关联。另外,在每天应激1小时,连续应激14天的动物脑片上,在海马的分子层和CA3区苔状纤维有硫磺素S染色加深,提示这些部位可能存在具有beta折叠结构的蛋白。3.GSK-3是参与tau蛋白磷酸化的主要激酶之一。在慢性束缚应激刺激后,在脑内tau蛋白磷酸化增加的同时,抑制型GSK-3β的含量增加,而抑制型GSK-3α的含量却反而减少,我们推测活化型的GSK-α可能起主要作用。免疫组化检测显示GSK-3α在海马中不同部位的染色深度与磷酸化tau并不完全一致,提示在应激导致的tau蛋白磷酸化的机制中除了GSK-3α外,还有其它激酶参与。小结：1.慢性束缚应激可增加脑内tau蛋白的磷酸化,而同时有MAP2表达减少。强应激刺激使不溶性的磷酸化tau增加。2.慢性束缚应激可使皮层和海马磷酸化tau蛋白的表达增多,并主要分布在胞体和树突；MAP2在树突的分布减少,同时伴有树突退行性变的表现。磷酸化tau蛋白的增多与MAP2减少有相关性。3.慢性束缚应激可增加脑内可诱导GSK-3α活化而抑制GSK-3β活性,提示在慢性束缚应激刺激诱导tau蛋白磷酸化的机制中可能有GSK-3α参与。结论：慢性束缚应激可诱导磷酸化tau蛋白增加和MAP2的减少,二者的变化有相关性。应激诱导的tau蛋白磷酸化可能与GSK-3α的活化有关,而慢性束缚应激的强度影响磷酸化tau蛋白的可溶性。