背景乳腺癌是全球最常见的肿瘤之一,排在女性肿瘤的首位,也是导致妇女死亡的主要原因。随着社会经济的发展、我国人们对乳腺的自我保健意识的加强以及乳腺癌的诊疗技术的进步,乳腺癌的死亡率正逐渐下降。但是,经历过乳腺癌的人却越来越多。肿瘤相关性疲劳(Cancer-related fatigue, CRF)是乳腺癌患者经历的最常见的不适之一。因此,如何提高这部分日益增多的人群的生活质量就变的越来越重要、越来越有意义。目前,国内外大批学者及临床医师对CRF进行了大量的研究,但CRF发生的病理生理学机制仍然不是很清楚。临床上也缺乏广泛认可、确切有效的干预手段。而中医药治疗作为中国传统特色疗法,在肿瘤综合治疗中的作用逐渐被大家认识。CRF的中医发病机制中最主要的是正气不足,气血阴阳亏损。肾中精气既可化生元气,还促进脾胃化生水谷精微,进而奉心化赤为血,又可与血互化,即精血同源也。因此,中医药干预CRF最重要应当是补肾固本。目前,国内对五子衍宗丸的研究及临床应用主要集中在泌尿生殖方面。而我们在临床中发现,五子衍宗丸不仅在泌尿生殖方面有非常好的效果,还发现其能提高人的生活质量。因此,本论文选择补肾方药为五子衍宗丸,用其在乳腺癌小鼠模型上进行干预CRF的相关实验研究,以期为临床运用五子衍宗丸干预CRF提供实验依据,并揭示其作用的代谢机制。目的通过建立乳腺癌小鼠CRF模型,评价中药复方五子衍宗丸对由肿瘤本身及肿瘤化疗所引起的乳腺癌小鼠CRF的作用,并明确中药复方五子衍宗丸缓解CRF的代谢组学机制。方法实验前,将所有雌性BALB/c小鼠置于游泳箱适应性游泳训练2天,5min/天,水温25℃±1℃。剔除游泳时间过长和过短的小鼠以及过于兴奋和过于安静的小鼠。然后,随机抽取10小鼠作为正常对照(NS, po,20ml/kg, qd)组,剩余小鼠为待制备乳腺癌小鼠CRF模型组。将1×105cells/ml的4T1乳腺癌细胞接种于小鼠右侧腹壁第4对乳房脂肪垫区域的皮下,制备乳腺癌小鼠CRF模型。当瘤块长到50mm3～100mm3(接种后第7天)的时候,按瘤体积随机分为4组,每组10只,分别为肿瘤对照(NS, po,20ml/kg, qd)组、紫杉醇(PTX, ip,10mg/kg, q2d)组、五子衍宗丸(WZYZ, po,1.5g/kg, qd)组、五子衍宗丸+紫杉醇(WZYZ, po,1.5g/kg, qd;PTX, ip,10mg/kg, q2d)组。上述5组小鼠分别进行以下几个方面的实验：(1)五子衍宗丸对荷瘤小鼠的一般情况的影响：观察实验过程中各组小鼠的体重、精神状态、活动情况、饮食以及皮毛外观变化。每周对上述小鼠的-般情况进行一次评价。(2)五子衍宗丸对荷瘤小鼠的行为学影响：给药的第12天对所有小鼠进行旷场实验。主要观察小鼠在实验箱内的总运动距离、外周格运动距离、中央格运动距离、理毛次数、爬壁次数、大便粒数。于末次给药后30mmin,观察小鼠6min内的悬尾不动时间。(3)五子衍宗丸的对荷瘤小鼠的生存时间的影响：末次药后,不再给予任何干预措施,动态观察荷瘤小鼠生存时间,并计算各组小鼠的中位生存时间、平均生存时间及生命延长率。(4)五子衍宗丸对荷瘤小鼠的抗疲劳作用：于开始给药前、给药后的第10天、第20天,用7%体重的铅坠系于小鼠尾部,将小鼠放入水温25℃±1℃的游泳箱中进行力竭游泳测试,并记录力竭游泳时间。(5)五子衍宗丸对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用：另取上述5组小鼠,各组小鼠自接受治疗开始,每3天测量肿瘤体积。在末次给药1小时后,摘眼球采血,分离血浆,置-80℃保存,用于代谢组学研究。并剥离瘤块并称重、计算抑瘤率。(6)五子衍宗丸对荷瘤小鼠脏器指数的影响：取前一实验中分离并称重的脾脏、胸腺、肾上腺等器官,按对应的每只小鼠的体重计算脏器指数。(7)五子衍宗丸对乳腺癌小鼠CRF血浆代谢组学的研究：应用核磁共振氢谱(1H-NMR)技术获取前面实验中小鼠血浆中的原始代谢指纹图谱信息,通过数据采集处理获得各样本数据信息,采用多元数据统计方法(PCA、PLS-DA、 OPLS-DA)模式识别等方法进行数据处理,得到5组小鼠血浆代谢概况,并进行组间两两比较(NC组与TC组、TC组与PTX组、过TC组与WZYZ组、TC组与WZYZ+PTX组、PTX组与WZYZ+PTX组、WZYZ组与WZYZ+PTX组)。最后结合模型VIP值、归一化积分值筛选出NC组与TC组、TC组与PTX组、过TC组与WZYZ组、TC组与WZYZ+PTX组、PTX组与WZYZ+PTX组、WZYZ组与WZYZ+PTX组组间小鼠血浆有差异的代谢物(潜在分子标志物),结合数据库和文献进行代谢物鉴定,并分析相关代谢途径变化,揭示乳腺癌小鼠CRF的发生机制、WZYZ缓解乳腺癌小鼠CRF的作用机制。结果(1)五子衍宗丸对荷瘤小鼠的一般情况的影响：给药干预前,5组小鼠之间的精神状态、活动情况、饮食以及皮毛外观等一般情况未见有显著差别。各组小鼠均活泼好动,皮毛光洁整齐,眼睛有神,对食物敏感,逃避反应快。整个实验过程中,NC组小鼠的上述情况未有显著变化。与NC组的小鼠比较,其余4组荷瘤小鼠均逐渐出现毛发稀疏、聚集、不活泼、行动迟缓和进食减少等现象。实验结束时,TC组、PTX组、WZYZ组和WZYZ+PTX组4组小鼠的一般情况从差到相对较好依次为PTX组、TC组、WZYZ组、WZYZ+PTX组。干预前,各组小鼠的体重无显著差别(P>0.05)。干预1周时,NC组小鼠的体重较干预前显著增加(P<0.01),且体重显著重于PTX组小鼠(P<0.01)。干预2周时,NC组小鼠的体重较干预前显著增加(P<0.01),但较干预1周时无显著增加(P>0.05)。TC组、WZYZ组和WZYZ+PTX组小鼠的体重较干预前无显著差异(P>0.05),但较干预1周时有显著差异(P<0.05)。PTX组小鼠的体重较干预前、干预1周时均有显著差异(P<0.01)。与NC组小鼠体重比较,TC组、PTX组、WZYZ组、WZYZ+PTX组的小鼠体重均分别有显著差异(P<0.01)。与TC组小鼠体重比较,NC组和PTX组小鼠的体重分别有显著差异(P<0.01)。与PTX组小鼠体重比较,NC组、TC组、WZYZ组、WZYZ+PTX组的小鼠体重均分别有显著差异(P<0.01)。干预3周时,各组小鼠的体重维持在第2周水平。(2)五子衍宗丸对荷瘤小鼠的行为学影响：①旷场实验结果：总运动距离最远的是NC组小鼠,PTX组最少。与NC组比较,TC组、PTX组小鼠的总运动距离均有显著差异(P<0.05～0.01)。外周格运动距离最远的是NC组小鼠,TC组最少。与NC组比较,TC组、PTX组、WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的外周格运动距离均有显著差异(P<0.05～0.01)。与TC组比较,NC组、WZYZ+PTX组的外周格运动距离均有显著差异(P<0.01)。中央格运动距离最远的是TC组小鼠,NC组最少。与NC组比较,TC组、WZYZ组小鼠的中央格运动距离均有显著差异(P<0.01)。与TC组比较,NC组、WZYZ+PTX组的中央格运动距离均有显著差异(P<0.05～0.01)。大便粒数,与NC组比较,TC组、WZYZ组小鼠的大便粒数显著增多(P<0.05),而PTX组小鼠的大便粒数显著减少(P<0.01)。与TC组比较,NC组、PTX组、WZYZ+PTX组的大便粒数均显著减少(P<0.05～0.01)。与PTX组比较,NC组、TC组、WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的大便粒数均显著增多(P<0.01)。爬壁次数,NC组小鼠的爬壁次数最多,而WZYZ组小鼠最少。与NC组比较,WZYZ组和WZYZ+PTX组小鼠的爬壁次数显著减少(P<0.05～0.01)。理毛次数,PTX组和WZYZ+PTX组小鼠的理毛次数相对较多,其次是正常组,TC组最少。与NC组比较,TC组和WZYZ组小鼠的理毛次数显著减少(P<0.05～0.01)。与TC组比较,NC组、PTX组和WZYZ+PTX组小鼠的理毛次数显著增多(P<0.01)。与PTX组比较,TC组、WZYZ组小鼠的理毛次数显著减少(P<0.01)。②悬尾实验结果：与NC组小鼠相比,TC组小鼠的不动时间有所延长,但无显著差异(P>0.05)。与TC组小鼠比较,WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的不动时间显著缩短(P<0.05～0.01)。(3)五子衍宗丸的对荷瘤小鼠的生存时间的影响：与TC组比较,PTX组、WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的中位生存时间及平均生存时间均显著延长(P<0.05～0.01)。与PTX组比较,TC组小鼠的中位生存时间及平均生存时间均显著缩短(P<0.01)。WZYZ+PTX组小鼠的中位生存时间及平均生存时间均显著延长(P<0.05)。与TC组小鼠相比,WZYZ+PTX组、WZYZ组和PTX组3组小鼠的生命延长率分别为26.07%、8.02%和13.03%。(4)五子衍宗丸对荷瘤小鼠的抗疲劳作用：①同一时间点各组小鼠力竭游泳时间的比较：干预前,5组小鼠的力竭游泳时间无显著差异(P>0.05)。干预第10天时,与NC组比较,TC组、PTX组、WZYZ+PTX组小鼠的力竭游泳时间显著减少(P<0.01)。与TC组比较,NC组小鼠的力竭游泳时间显著延长(P<0.01),而PTX组、WZYZ组、WZYZ+PTX组的游泳时间无显著差异(P>0.05)。与PTX组比较,NC组、WZYZ组小鼠的力竭游泳时间显著延长(P<0.05～0.01)。干预20天时,与NC组比较,TC组、PTX组、、WZYZ组(P<0.01)和WZYZ+PTX组小鼠的力竭游泳时间显著减少(P<0.01)。与TC组比较,NC组小鼠的力竭游泳时间显著延长(P<0.01),而PTX组、WZYZ组、WZYZ+PTX组的游泳时间无显著差异(P>0.05)。与PTX组比较,NC组、WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的力竭游泳时间显著延长(P<0.05～0.01)。②不同时间点的同组小鼠力竭游泳时间比较：对于NC组小鼠而言,与干预前比较,干预第10天、干预第20天的游泳时间显著延长(P<0.05-0.01)；与干预第10天比较,干预第20天时小鼠的游泳能力无显著变化(P>0.05)。对于TC组小鼠而言,与干预前比较,干预第10天游泳时间有下降趋势,但无显著差异(P>0.05),而干预第20天的游泳时间显著下降(P<0.01)；与干预第10天比较,干预第20天时小鼠的游泳能力显著下降(P<0.05)。对于PTX组小鼠而言,与干预前比较,干预第10天、干预第20天的游泳时间显著下降(P<0.01)；与干预第10天比较,干预第20天时小鼠的游泳能力显著下降(P<0.01)。对于WZYZ组小鼠而言,与干预前比较,干预第10天时小鼠的游泳能力无显著变化(P>0.05),干预第20天时小鼠的游泳能力显著下降(P<0.05)；与干预第10天比较,干预第20天时小鼠的游泳能力显著下降(P<0.01)。对于WZYZ+PTX组小鼠而言,与干预前比较,干预第10天、干预第20天时小鼠的游泳能力显著下降(P<0.05-0.01)；与干预第10天比较,干预第20天时小鼠的游泳能力无显著变化(P>0.05)。(5)五子衍宗丸对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用：实验结束时,与TC组比较,WZYZ+PTX组、PTX组的瘤重均显著减轻(P<0.01)；与TC组比较,WZYZ+PTX组的肿瘤体积显著变小(P<0.05)。WZYZ+PTX组、WZYZ组和PTX组3组小鼠的抑瘤率分别为33.66%、20.65%和7.16%。(6)五子衍宗丸对荷瘤小鼠脏器指数的影响：①脾指数：与NC组比较,TC组、PTX组、WZYZ组和WZYZ+PTX组的脾指数均显著升高(P<0.01)。与TC组比较,PTX组、WZYZ组、WZYZ+PTX组的脾指数无显著差异(P>0.05)。与PTX组比较,WZYZ组、WZYZ+PTX组的脾指数无显著差异(P>0.05)。②胸腺指数：NC组小鼠的胸腺指数最高,PTX组最小。与NC组比较,TC组、PTX组、WZYZ组和WZYZ+PTX组的胸腺指数显著下降(P<0.01)。与TC组比较,PTX组的胸腺指数显著下降(P<0.01),而WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的胸腺指数无显著差异(P>0.05)。与PTX组比较,WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的胸腺指数显著升高(P<0.01)。③肾上腺指数：与NC组比较,TC组、PTX组的肾上腺指数显著升高(P<0.01)。与TC组比较,WZYZ+PTX组小鼠的肾上腺指数显著降低(P<0.05)。与PTX组比较,WZYZ组、WZYZ+PTX组小鼠的肾上腺指数无显著差异(P>0.05)。(7)五子衍宗丸对乳腺癌小鼠CRF血浆代谢组学的研究：①五组小鼠之间血浆NMR的分析：用PLS-DA模型,最终计算出5组小鼠血浆样本共有4个主成分,5组之间基本分离,且各组相关集中,组间可基本区分。②NC组与TC组组间两两比较：采用PCA、PLS-DA方法进行数据处理和模式识别后,TC组和NC组各自集中,两组可完全区分。进一步用OPLS-DA模型处理数据后,两组样本集中趋势更显著,分类效果更好。综合载荷矩阵图、S图、VIP值、归一化积分值共筛选得到18个有统计学意义的变量(P<0.05-0.01)。与NC组小鼠比较,TC组小鼠血浆中的异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、精胺、精氨琥珀酸、甘油磷酸酯、3-羟基丁酸水平升高,3-羟基月桂酸、3-羟基异戊酸、甲基丙二酸、天冬氨酸、神经酸水平下降。这些化合物与脂肪酸代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢、丙酮酸代谢、糖异生、葡萄糖-丙氨酸循环、β-丙氨酸代谢、线粒体电子传递链、苹果酸-天冬氨酸穿梭等多个代谢通路相关。③TC组与PTX组小鼠组间两两比较：采用PCA、PLS-DA方法进行数据处理和模式识别后,TC组和PTX组各自集中,两组可完全区分。进一步用OPLS-DA模型处理数据后,两组样本集中趋势更显著,两组小鼠两组样本之间显著区分,但PTX组样本之间较TC组分散。综合载荷矩阵图、S图、VIP值、归一化积分值共筛选得到14个有统计学意义的变量(P<0.05～0.01)。与TC组小鼠比较,PTX组小鼠血浆中的亚精胺、二羟基丙酮、磷酸胆碱、肌醇、瓜氨酸水平升高,甘油磷酸酯、丙酰甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、葡萄糖-6-磷酸、赤藓糖、神经酸水平下降。这些化合物与丙酮酸代谢、氨基酸代谢、亚精胺和精胺代谢、脂肪酸代谢、半乳糖代谢、肌醇代谢、甘油磷酸穿梭等多个代谢通路相关。④TC组与WZYZ组组间两两比较：采用PCA、PLS-DA方法进行数据处理和模式识别后,TC组和WZYZ组各自集中,两组可完全区分。进一步用OPLS-DA模型处理数据后,两组样本集中趋势更显著,分类效果更好。综合载荷矩阵图、S图、VIP值、归一化积分值共筛选得到2个有统计学意义的变量(P<0.05～0.01)。与TC组小鼠比较,WZYZ组小鼠血浆中的甘油磷酸酯水平升高,肌醇水平下降。这2个化合物与肌醇代谢、甘油脂质代谢、甘油磷酸穿梭、线粒体电子传递链等多个代谢通路相关。⑤TC组与WZYZ+PTX组组间两两比较：采用PCA、PLS-DA方法进行数据处理和模式识别后,TC组和WZYZ+PTX组各自集中,两组可完全区分。进一步用OPLS-DA模型处理数据后,两组样本集中趋势更显著,分类效果更好。综合载荷矩阵图、S图、VIP值、归一化积分值共筛选得到17个有统计学意义的变量(P<0.05～0.01)。与TC组小鼠比较,WZYZ+PTX组小鼠血浆中的2-羟基丁酸、异亮氨酸、皮质酮、瓜氨酸、丙酰甘氨酸水平升高,谷氨酸、丙酮酸、亚精胺、丙二酸、二羟基丙酮、β-丙氨酸、磷酸胆碱、肌醇、天冬氨酸、丝氨酸3-羟基丁酸水平下降。这些化合物与三羧酸循环、脂肪酸代谢、丙酸代谢、亚精胺和精胺代谢、氨基酸代谢、糖异生、葡萄糖-丙氨酸循环、甘氨酸和丝氨酸代谢、糖酵解、丙酮酸代谢、肌醇代谢、甘油磷酸穿梭、线粒体电子传递链、苹果酸-天冬氨酸穿梭、磷脂的合成等多个代谢通路相关。⑥PTX组与WZYZ+PTX组组间两两比较：采用PCA、PLS-DA方法进行数据处理和模式识别后,PTX组和WZYZ+PTX组各自集中,两组可完全区分。进一步用OPLS-DA模型处理数据后,两组样本集中趋势更显著,分类效果更好。综合载荷矩阵图、S图、VIP值、归一化积分值共筛选得到3个有统计学意义的变量(P<0.05～0.01)。与PTX组小鼠比较,WZYZ+PTX组小鼠血浆中的赤藓糖、神经酸、磷酸烯醇丙酮酸水平升高。这3个化合物主要与磷酸戊糖途径、糖酵解、丙酮酸代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等多个代谢通路相关。⑦WZYZ组与WZYZ+PTX组组间两两比较：采用PCA、PLS-DA方法进行数据处理和模式识别后,WZYZ组和WZYZ+PTX组两组分离趋势增强,但仍存在一定的重叠,两组尚未能完全区分开来。进一步用OPLS-DA模型处理数据后,两组样本集中趋势更显著,分类效果更好。综合载荷矩阵图、S图、VIP值、归一化积分值共筛选得到8个有统计学意义的变量(P<0.05～0.01)。与WZYZ组小鼠比较,WZYZ+PTX组小鼠血浆中的2-羟基丁酸、异亮氨酸、辛酰甘氨酸、皮质酮、磷酸胆碱、甘油磷酸酯、瓜氨酸、丙酰甘氨酸水平升高。这些化合物与三羧酸循环、脂肪酸代谢、丙酸代谢、线粒体电子传递链、氨基酸代谢、类固醇合成、甘油磷酸穿梭、甘油脂质代谢、线粒体电子传递链、磷脂的合成等多个代谢通路相关。结论1、在4TI乳腺癌细胞接种于右侧腹壁第4对乳房脂肪垫区域的皮下制备的乳腺癌小鼠模型存在CRF,且CRF的程度随肿瘤的生长而加重。乳腺癌小鼠CRF的发生机制可能与肿瘤本身的增殖所导致的脂肪酸代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢、丙酮酸代谢、糖异生、葡萄糖-丙氨酸循环、β-丙氨酸代谢、线粒体电子传递链、苹果酸-天冬氨酸穿梭等多个代谢通路紊乱有关。2、应用PTX对乳腺癌小鼠化疗能加重乳腺癌小鼠的CRF,且CRF的程度随化疗的时间延长而加重。PTX加重乳腺癌小鼠的CRF的发生机制可能与PTX引起小鼠丙酮酸代谢、氨基酸代谢、亚精胺和精胺代谢、脂肪酸代谢、半乳糖代谢、肌醇代谢、甘油磷酸穿梭等多个代谢通路紊乱有关。3、单独应用WZYZ能显著改善荷瘤小鼠的一般情况、延长小鼠生存时间,实验过程中有缓解乳腺癌小鼠CRF的作用的趋势,但无统计学差异。WZYZ对乳腺癌小鼠CRF的影响可能是通过调节肌醇代谢、甘油脂质代谢、甘油磷酸穿梭、线粒体电子传递链等多个代谢通路有关。4、WZYZ和PTX联合应用能显著改善由肿瘤本身及肿瘤化疗所引起的CRF,且效果比单独应用WZYZ好。WZYZ和PTX联合应用缓解乳腺癌小鼠的CRF作用机制可能是通过调节三羧酸循环、脂肪酸代谢、丙酸代谢、亚精胺和精胺代谢、氨基酸代谢、糖异生、葡萄糖-丙氨酸循环、甘氨酸和丝氨酸代谢、糖酵解、丙酮酸代谢、肌醇代谢、甘油磷酸穿梭、线粒体电子传递链、苹果酸-天冬氨酸穿梭、磷脂的合成等多个代谢通路有关。