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乳腺癌是世界范围内临床常见恶性肿瘤之一,严重威胁女性生命和健康,其发病率及死亡率在多种恶性肿瘤中一直位居前列,且呈持续上升趋势。三阴乳腺癌是乳腺癌的常见生物亚型,其病理特征是孕激素受体(PR)-阴性,雌激素受体(ER)-阴性和HER2-阴性。三阴乳腺癌患者特异性存活较差,早期肿瘤复发率较高,更易发生癌症扩散,在内脏和中枢神经系统转移率较高。目前临床上缺乏对三阴乳腺癌的有效治疗策略,因此天然药物筛选和新药研发为三阴乳腺癌治疗提供了新的希望。C-藻蓝蛋白(C-phycocyanin,C-PC),一种提取自螺旋藻的多亚基蛋白复合物,其氨基酸组成丰富,必须氨基酸含量高,营养价值优于其他海洋蛋白质,而且C-藻蓝蛋白具备安全无毒、提取纯化简便、着色力强、水溶性好等特点,普遍用于食品、保健品、化妆品、科研和染料等诸多行业。通过医药领域的研究发现,C-藻蓝蛋白发挥抗氧化、抗炎、抗肿瘤、增强机体免疫力、肝脏及神经保护等诸多生理活性。大量研究表明,藻蓝蛋白在多种癌症类型(如乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌和白血病等)中发挥抗肿瘤作用,因此C-藻蓝蛋白作为一种潜在的抗肿瘤药物,具有重要的研究和利用价值。纳米技术和医药领域的结合为新药研发提供了新思路,纳米药物降低了传统药物治疗的毒副作用,延长传统药物的半衰期,改变药物在体内的代谢途径,增强药物的药理活性,从而发展成为癌症治疗新策略。肿瘤靶向纳米药物具有选择性和靶向性输送药物的特点,能够选择性的将药物靶向到肿瘤部位,提高纳米药物的靶向性、准确性和安全性,进而使正常部位逃避了传统药物的杀伤作用。本课题旨在研究C-藻蓝蛋白对于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的抗肿瘤作用,并利用纳米医药技术,构建C-藻蓝蛋白纳米药物,能够克服C-藻蓝蛋白本身易降解、稳定性差、易变性失活等缺点,从而使C-藻蓝蛋白在体内的稳定输送成为可能。本研究为C-藻蓝蛋白的开发与肿瘤靶向治疗提供了新的方向,具有重要的理论意义与研究价值。目的通过体外细胞实验研究C-藻蓝蛋白对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移的影响,进一步揭示C-藻蓝蛋白抗乳腺癌活性的分子机制,并探索MAPK级联通路的作用。同时,利用纳米医药技术,将羧甲基壳聚糖(CMC)、C-藻蓝蛋白(C-PC)、CD59配体肽(CD59sp)有机地结合起来,构建C-PC/CMC-CD59sp靶向纳米微球,最大程度的发挥C-PC的抗肿瘤作用。C-PC充当抗肿瘤的模式药物,CMC为纳米药物载体,CD59sp为纳米药物靶向分子,实现C-PC的高效靶向输送,并对该纳米药物对MDA-MB-231细胞的安全性、靶向性、高效性进行研究。通过体外和体内实验,探索C-PC/CMC-CD59sp靶向纳米药物对乳腺癌细胞的体外生长抑制作用、靶向性和体内肿瘤抑制作用,并与C-PC、C-PC/CMC纳米药物进行比较,分析C-PC/CMC-CD59sp靶向纳米药物的优缺点。方法1.通过CCK8实验和平板克隆形成实验探索C-藻蓝蛋白对MDA-MB-231细胞增殖的影响;通过流式细胞术检测C-藻蓝蛋白对MDA-MB-231细胞周期检测点的影响,并通过Western Blot方法检测Cyclins、CDKs和CDKIs的表达;通过流式细胞术和TUNEL方法检测C-藻蓝蛋白对MDA-MB-231细胞凋亡的影响,同时通过Western Blot方法检测C-藻蓝蛋白对死亡受体信号通路的调控情况;通过细胞划痕试验和Transwell转移实验检测C-藻蓝蛋白对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响,通过免疫荧光实验观察C-藻蓝蛋白处理后MDA-MB-231细胞的形态学变化;通过Western Blot和qPCR方法检测C-藻蓝蛋白对COX-2表达的影响。2.通过Western Blot方法检测C-藻蓝蛋白处理后MDA-MB-231细胞AKT以及MAPK信号通路的激活情况;用MAPK信号通路抑制剂拯救C-藻蓝蛋白处理的MDA-MB-231细胞,对MAPK信号通路的激活进行验证。3.通过纳米技术制备C-PC/CMC和C-PC/CMC-CD59sp纳米药物,利用马尔文激光粒度仪检测纳米药物的粒径和Zeta电势。4.实验分为六组:Control、CMC、CD59sp、C-PC、C-PC/CMC和C-PC/CMC-CD59sp处理组。通过CCK8实验和克隆形成实验检测五种药物对乳腺癌MDA-MB-231细胞的细胞毒性作用;通过流式细胞术检测五种药物对MDA-MB-231细胞周期检测点的影响;通过流式细胞术和TUNEL方法检测五种药物对MDA-MB-231细胞凋亡的影响;通过划痕试验和Transwell转移实验检测五种药物对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响;通过Western Blot和qPCR方法检测五种药物对MDA-MB-231细胞COX-2和MMP-2表达的影响。5.通过流式细胞仪检测不同药物处理组MDA-MB-231细胞的C-藻蓝蛋白摄取率;构建HCCLM3 CD59过表达稳筛细胞株、HepG2和MDA-MB-231 CD59基因敲除稳筛细胞株,用流式细胞仪检测三组稳筛细胞株的C-PC/CMC-CD59sp摄取率。6.NU/NU裸鼠腋窝皮下注射MDA-MB-231细胞,构建荷瘤小鼠动物模型,分为Control、CMC、CD59sp、C-PC、C-PC/CMC和C-PC/CMC-CD59sp处理组;药物处理后观察小鼠体积及体重、瘤块体积和重量,研究纳米微球的体内抗肿瘤作用。结果1.C-藻蓝蛋白能够有效抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231的细胞增殖及克隆形成能力;C-藻蓝蛋白通过上调MDA-MB-231细胞中p21和p27蛋白的表达,抑制Cyclin D1和CDK2的表达,诱导MDA-MB-231细胞G0/G1期细胞周期阻滞;C-藻蓝蛋白通过激活膜死亡受体信号通路,诱导MDA-MB-231细胞凋亡;C-藻蓝蛋白在蛋白和mRNA水平上调COX-2的表达,抑制MDA-MB-231细胞迁移。2.C-藻蓝蛋白通过上调MDB-MA-231细胞中磷酸化JNK和p38表达,同时下调磷酸化ERK1/2蛋白表达,从而抑制乳腺癌细胞增殖;因此C-藻蓝蛋白可以通过调控MAPK信号通路发挥抗乳腺癌MDB-MA-231的作用。3.通过离子交联技术成功构建了C-PC/CMC纳米微球;C-PC/CMC纳米微球形态均匀,粒径大约分布在149.6±52.5nm,Zeta电势为-19.8±4.19 mV。4.C-PC/CMC-CD59sp纳米微球能够高效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及平板克隆形成能力;C-PC/CMC-CD59sp纳米微球上调p21和p27蛋白的表达,抑制Cyclin D1/CDK4和Cyclin E/CDK2的表达,进而诱导MDA-MB-231细胞G0/G1期细胞周期停滞;C-PC/CMC-CD59sp纳米微球激活Fas/FasL介导的细胞膜表面死亡受体信号通路,诱导MDA-MB-231细胞凋亡;C-PC/CMC-CD59sp纳米微球以剂量依赖性方式显著下调MMP-2和COX-2蛋白的表达,抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。5.C-PC/CMC-CD59sp药物处理组荧光强度最强;HCCLM3-CD59细胞的荧光强度显著强于HCCLM3和HCCLM3-NC细胞;MDA-MB-231-CD59-sgRNA细胞的荧光强度明显低于MDA-MB-231和MDA-MB-231-NC-sgRNA细胞;HepG2-CD59-sgRNA细胞的荧光强度明显低于HepG2和HepG2-NC-sgRNA细胞。6.六组荷瘤小鼠在给药期间没有表现出显著性体重差异及体型变化;在C-PC、C-PC/CMC和C-PC/CMC-CD59sp处理组中,荷瘤小鼠肿瘤的生长被抑制,但C-PC和C-PC/CMC的抑制效果显著低于C-PC/CMC-CD59sp纳米微球组,C-PC/CMC-CD59sp纳米微球组瘤块体积最小,重量最轻。结论1.C-藻蓝蛋白通过上调磷酸化JNK和p38表达,同时下调磷酸化ERK1/2蛋白表达,从而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞周期G0/G1期停滞,诱导细胞凋亡,因此C-藻蓝蛋白可以通过调控MAPK信号通路发挥抗乳腺癌MDA-MB-231的作用。2.C-PC/CMC-CD59sp可以通过CD59配体肽与肿瘤细胞表面的CD59蛋白结合,将C-PC/CMC-CD59sp纳米微球靶向到肿瘤部位。3.C-PC/CMC-CD59sp纳米微球其抗肿瘤作用主要通过体现在抑制乳腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡、阻碍细胞周期进程和抑制肿瘤细胞转移来实现的。4.C-PC、C-PC/CMC和C-PC/CMC-CD59sp纳米微球能够抑制动物模型肿瘤生长,C-PC/CMC-CD59sp的抑瘤效果最明显,同时C-PC、C-PC/CMC和CPC/CMC-CD59sp纳米微球没有明显的毒性;C-PC可以借助纳米技术进一步增强其抗肿瘤效果,并且在肿瘤靶向性的作用下,C-PC/CMC-CD59sp的抗肿瘤效果更显著。本课题利用纳米科技成功制备靶向纳米药物C-PC/CMC-CD59sp,并证实该纳米药物具有安全性、靶向性和高效性。该靶向纳米药物的靶向抗肿瘤作用主要通过抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、阻断细胞周期进程、诱导细胞凋亡、抑制细胞迁移来实现的。本研究为海洋药物的研发及C-藻蓝蛋白的临床应用提供了新的思路,并对肿瘤靶向治疗及纳米医药研究提供了新的方向和理论支持。