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本研究用荧光差异显示二维凝胶电泳技术对冠心病血瘀证患者、冠心病非血瘀证患者、健康志愿者、冠状动脉粥样硬化症患者间的血小板差异表达功能蛋白进行了筛选,应用基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱技术对目标蛋白鉴定,并对成功鉴定功能蛋白在冠心病血瘀证发生发展中的作用进行了分析。
按照冠心病西医诊断标准和血瘀证中医诊断标准筛选病例入组,设立冠心病血瘀证组、冠心病非血瘀证组、健康对照组、冠状动脉粥样硬化症组,检测单核细胞-血小板聚集评价各组血小板活化水平；分离制备血小板全蛋白,并对各个2-D DIGE上样蛋白进行二维凝胶电泳加银染,对其做初步分析,确证各个上样血小板蛋白提取理想,之后进行2-D DIGE,用Typhoon9410扫描仪在488nm,532nm,633nm波长分别对Cy2,Cy3,Cy5荧光染料标记的蛋白(图像)进行扫描。获取的各胶图导入DeCyder2D version6.5 software(图像分析系统),取T检测值P<0.05,差异倍数大于1.5倍的结果,进行差异分析。根据差异分析结果,确定最终切取蛋白点。加大蛋白上样量,制取制备胶,用考马斯亮蓝染色,与差异分析获得的的差异点图进行匹配,从制备胶上切取差异点对应胶粒,进行胶内酶解,以TFA水溶液提取酶解肽段,提取液0.5μl点于质谱仪的靶上,用美国ABI-4800型反射式基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪进行质谱分析。将质谱分析数据导入GPS检索软件,设置误差MS0.3 Da；MSMS0.2Da,在人的数据库IPI HUMAN3.23中进行匹配,取蛋白质打分大于64分,置信水平在95％以上者为鉴定成功蛋白点。
在冠心病血瘀证组与健康对照组之间血小板差异表达蛋白有:Isoform2 ofIntegrin alpha-Ⅱb(WB验证)和Isoform1 of Integrin alpha-Ⅱb均是血小板膜蛋白CD41的亚型；Actin-cytoplasrnie2(Actinγ,血小板细骨架蛋白的组成部分。WB验证。)；cDNA FLJ52842(highly similar to Actin,cytoplasmic1)、cDNAFLJ55253(highly similar to Actin-cytoplasmic1)、Actin-cytoplasmic1、cDNAFLJ43573 fis,clone RECTM2001691(highly similar to Actin,cytop)均可能是Actin其他亚型,或修饰产物。说明除血小板膜蛋白外,细胞骨架蛋白在血小板的活化进程中和Locomotion中发挥了不可忽视的作用。如活化血小板α颗粒释放和致密体分泌,释放血小板活化级联放大效应物质,骨架蛋白重构,与膜αⅡb-Ⅲa牢固连接,随之继发血小板变形、相互聚集、与纤维蛋白交接,形成血栓。
冠心病血瘀证组与冠心病非血瘀证组间筛选到10个血小板差异表达蛋白点:cDNA FLJ53327(Gelsolin)、cDNA FLJ43573 fis(clone RECTM2001691,highlysimilar to Actin,cytop)在冠心病血瘀证组患者血小板表达增多； Isoform2 ofIntegrin alpha-Ⅱb、Fibrinogen beta chain(WB验证)、Actin-cytoplasmic1、Actin—cytoplasmic2、cDNA FLJ52842(highly similar to Actin,cytoplasmic1)、Keratin typeⅠ(cytoskeletal10)、FGG50 kDa protein、A26C1B ANKRD26-like在冠心病血瘀证组患者血小板表达减少。
纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)是凝血因子,由三对多肽链(一对α链、一对β链、一对γ链)组成。血小板膜结合Fg的量可作为判定血小板聚集活性的早期指标。本研究发现冠心病血瘀证患者血小板结合的纤维蛋白原中Fibrinogenβ链比非血瘀证低,说明冠心病血瘀证患者血小板结合的纤维蛋白原少,同时Isoform2 of Integrin alpha-Ⅱb(CD41,血小板膜蛋白)在冠心病血瘀证患者m小板的表达也较非血瘀证低。说明冠心病血瘀证患者血小板在发生进一步活化、聚集前,可结合的纤维蛋白原容量低,在相对偏高的血浆纤维蛋白原水平环境下；加之Gelsolin高表达,其在Ca2+的参与下通过切断Actin filaments,增加Barbed ends,调控血小板骨架蛋白的重构,导致血小板变形,参与血栓形成。所以更易发生活化聚集形成血栓,导致事件发生。除FGG50 kDa protein、A26C1B ANKRD26-like外,另外5个是血小板骨架蛋白或者类似物,进一步说明骨架蛋白在血小板的活化进程中确实发挥了作用。
冠心病非血瘀证与健康对照组间筛选到6个差异表达蛋白:分别是KRT10Keratin,typeⅠ cytoskeletal10; ACTG1 Actin,cytoplasmic；ACTB Actin,cytoplasmic1； ACTB cDNA FLJ52842,highly similar to Actin,cytoplasmic1；FGG50 kDa protein；A26C1B ANKRD26-like。前3个是血小板骨架蛋白,第四个是骨架蛋白类似物(可能为Actin的修饰产物),最后两个可能是新蛋白。它们在健康对照组、冠心病血瘀证组、冠心病非血瘀证组中,依次升高:FGG50 kDaprotein在冠心病非血瘀证组的表达分别是冠心病血瘀证组的1.52倍、健康对照组的2.76倍；ACTG1 Actin,cytoplasmic在冠心病非血瘀证组的表达分别是冠心病血瘀证组的2.29倍、健康对照组的4.97倍；KRT10 Keratin,typeⅠ cytoskeletal10、ACTB Actin,cytoplasmic1、ACTB cDNA FLJ52842,highly similar to Actin,cytoplasmic1、A26C1B ANKRD26-like等4个蛋白在三组中的表达差异量则均在前两者之间。从蛋白表达量与功能相对应的角度看,除外FGG50 kDa protein,其他5个蛋白可能在血小板活化时的骨架蛋白构型改变中,发挥抗血小板骨架蛋白构型改变作用。在其他细胞研究中,发现KRT10 Keratin,typeⅠ cytoskeletal10主要抑制细胞增殖,通过调节pRb(retinoblastoma protein)磷酸化,作为负向调节者参与到PI-3K(the phosphoinosifide3-kinase)信号转导通路,发挥作用。因为血小板不存在细胞分裂增殖,推测KRT10 Keratin,typeⅠ cytoskeletal10在血小板中,可能发挥抑制血小板骨架蛋白构型改变的保守作用,阻碍血小板的变形,产生了阻碍血小板相互聚集作用,降低血栓形成倾向。初步说明冠心病非血瘀证患者较冠心病血瘀证患者有着一定防御血小板过度活化参与血栓形成的调控机制。其余5个蛋白未见到相关功能研究报道。
冠状动脉粥样硬化症与健康对照组间共筛选到12个血小板差异表达蛋白点:Isoform2 of Integrin alpha—Ⅱb；Isoform1 of Integrin alpha-Ⅱb；Actin,cytoplasmic2； cDNA FLJ52842,highly similar to Actin,cytoplasmic1； Actin,cytoplasmic1:FGG50 kDa protein；A26C1B ANKRD26-like；YWHAZ14-3-3proteinzeta/delta；KRT10 Keratin,typeⅠ cytoskeletal10；FGB Fibrinogen beta chain;FLNA Putative uncharacterized protein FLNA(Fragment)；THBS1Thrombospondin—1。这些蛋白中,Isoform1 of Integrin alpha-Ⅱb；Actin,cytoplasmic2；cDNA FLJ52842,highly similar to Actin,cytoplasmic1；Actin,cytoplasmic1等冠心病血瘀证患者血小板中表达增高；YWHAZ14-3-3 proteinzeta/delta在冠心病非血瘀证患者血小板中表达增高。
我们选择功能相对明确的cDNAFLJ53327(Gelsolin)为观测指标,进行了体外活血化瘀中药有效成分的干预研究。分为5组:①Control group:PLT150ul；②(PLT150ul+2μMADP)组；③(PLT150ul+20μMADP)；④(PLT150ul+20μMADP+20μL川芎嗪)组；⑤(PLT150ul+20μM ADP+20μL阿魏酸),用Elisa方法检测盐酸川芎嗪和阿魏酸对血小板Gelsolin的表达影响。结果:①对照组与③组之间有差异(P<0.05)；③组分别与④组、⑤组比较,组间均无差异(P>0.05),但Gelsolin的表达在④组、⑤组均有明显下降。初步说明川芎嗪和阿魏酸能降低血小板活化时Gelsolin的表达,从而发挥抗血小板活化作用。