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目的初步探究靶向发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)非结构蛋白NSs(non-structural proteins)的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)是否抑制SFTSV复制,进一步探索SFTSV NSs基因功能及其在病毒复制中的重要性,探究shRNA介导的抗病毒作用是否可能成为控制SFTSV感染的潜在新工具。方法1.病毒经Vero细胞扩增后,用间接免疫荧光法、Western Blotting检测扩增的SFTSV是否成功,之后用间接免疫荧光方法检测病毒滴度。2.构建靶向SFTSV NSs的shRNA质粒,经公司测序和Eco RI/NcoΙ双酶切验证所构建的质粒。3.分别将测序成功的SFTSV NSs-shRNA1、SFTSV NSs-shRNA2质粒和SFTSV NSs-Flag质粒共转染后Western Blotting验证质粒是否起作用,后续实验选择抑制效果好的质粒SFTSV NSs-shRNA1。4.Vero细胞分别经Non-Target shRNA和SFTSV NSs-shRNA1转染后再感染SFTSV,进行免疫荧光及Western Blotting验证沉默NSs是否对病毒感染产生抑制作用。5.用0.8μg的SFTSV NSs-shRNA1转染Vero细胞再感染相同MOI值的SFTSV,在感染后的不同时间(24 h、48 h、72 h)收集上清液,通过TCID50测量上清液病毒滴度(用0.8μg的Non-Target shRNA作为对照,与干扰组做相同处理)。分别用不同浓度(0.4μg、0.8μg、1.2μg)的SFTSV NSs-shRNA1转染Vero细胞后再感染相同MOI值的SFTSV,在感染后24 h收集上清液,通过TCID50测量上清液病毒滴度(Non-Target shRNA作为对照,用量与处理方法同干扰组)。用0.8μg的SFTSV NSs-shRNA1转染Vero细胞再分别感染不同MOI值(0.1 MOI、1 MOI、5 MOI)的SFTSV,在感染后24 h收集上清液,通过TCID50测量上清液病毒滴度(用0.8μg的Non-Target shRNA作为对照,与干扰组做相同处理)。结果1.经间接免疫荧光和Western Blotting检测得出SFTSV病毒成功扩增,感染后16 h间接免疫荧光方法测定的滴度为2.33X108 FFU/m L。2.经测序和琼脂糖凝胶电泳检测,成功构建了靶向SFTSV NSs的shRNA质粒。3.Western Blotting检测结果显示共转染质粒组比单独转染SFTSV NSs-Flag组蛋白弱,且SFTSV NSs-shRNA1质粒抑制效果好。4.经间接免疫荧光检测转染SFTSV NSs-shRNA1质粒后感染SFTSV组与对照组(转染Non-Target shRNA质粒后感染SFTSV组)相比,荧光明显减弱且几乎不能看到,Western Blotting检测同样是干扰组蛋白减弱,表明构建的SFTSV NSs-shRNA1质粒能抑制SFTSV的复制。5.通过TCID50测量不同干扰时间(24 h、48 h、72 h)、不同浓度shRNA(0.4μg、0.8μg、1.2μg)干扰、干扰后不同MOI值(0.1 MOI、1 MOI、5 MOI)SFTSV感染的上清液病毒滴度,与对照组相比各组结果均显示降低,差异有统计学意义(P<0.05),表明构建的SFTSV NSs-shRNA1质粒能抑制SFTSV的复制。并且得出SFTSV NSs-shRNA1至少在72 h内能抑制病毒复制;质粒浓度越高(1.2μg),抑制作用越强;MOI值升高时抑制率略有下降。结论成功构建了靶向SFTSV NSs的shRNA,并且其能抑制SFTSV复制,为后续研究控制SFTSV感染的潜在手段提供实验基础。