【摘 要】
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甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitaminea）是担子菌亚门孢堆黑粉菌属真菌,主要危害甘蔗。甘蔗鞭黑粉菌是二态型真菌,单倍体不致病,只有当两个不同性系的单倍体进行有性配合形成双核菌丝体时,才具有侵染宿主的能力。膜泡运输是细胞输送各类营养物质以及信号转导的重要途径。本研究在甘蔗鞭黑粉菌中鉴定了一个参与膜泡形成的Ss DID4基因,分析了其在有性配合及抗逆胁迫中的重要作用,主要研究结果如下
【基金项目】
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国家重点基础研究发展计划（973 计划）项目（微生物通讯系统与病害防控基础研究,2015CB150600）之子课题（甘蔗鞭黑穗病菌有性配合信号系统的研究）；
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甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitaminea）是担子菌亚门孢堆黑粉菌属真菌,主要危害甘蔗。甘蔗鞭黑粉菌是二态型真菌,单倍体不致病,只有当两个不同性系的单倍体进行有性配合形成双核菌丝体时,才具有侵染宿主的能力。膜泡运输是细胞输送各类营养物质以及信号转导的重要途径。本研究在甘蔗鞭黑粉菌中鉴定了一个参与膜泡形成的Ss DID4基因,分析了其在有性配合及抗逆胁迫中的重要作用,主要研究结果如下:（1）以甘蔗鞭黑粉菌野生型WT17为研究对象,利用PEG介导的原生质体转化,获得同源敲除突变体ssdid4Δ,并对其进行基因回补,获得回补突变体Ss DID4-COM。FM4-64染色结果显示,膜泡在突变体ssdid4Δ中的形成受阻,在互补体中得到恢复,表明Ss Did4是膜泡形成必需的。（2）对突变体进行有性配合的表型分析,发现ssdid4Δ与WT18混合后表现为弱配合,Ss DID4-COM有性配合完全恢复。外源添加人工合成的WT18的性信息素Mfa2,结果显示Mfa2能促进WT17和Ss DID4-COM单倍体产生菌丝,但对ssdid4Δ没有影响。外源添加5m M c AMP不能恢复ssdid4Δ的有性配合,荧光定量PCR结果显示ssdid4Δ中c AMP-PKA的Ss GPA3、Ss UAC1、Ss ADR1表达也没有受影响。检测MAPK通路的关键基因CRK1、FUZ7、KPP2、PRF1及其下游a,b位点的基因的表达量发现这些基因表达都显著下调。这些结果表明Ss DID4可能影响信息素信号的转运并通过MAPK通路调控甘蔗鞭黑粉菌的有性配合。（3）对突变体生长和显微形态进行观察发现,ssdid4Δ生长显著减慢,且单倍体菌体呈串连的类似假菌丝体的形态;细胞壁应激表型分析,显示ssdid4Δ对刚果红（1.0mg/m L）敏感,但对CFW（荧光增白剂,0.5 mg/m L）不敏感;对突变体进行二价离子耐受性检测,结果表明ssdid4Δ对Zn2+（5 m M）、Fe2+（7.5 m M）、Cu2+（7.5 m M）、Mn2+（5 m M）、Mg2+（800 m M）等二价金属离子的耐受性显著降低;此外,突变体ssdid4Δ对SDS（0.004%）、EGTA（2.5 m M）的耐受性也显著降低;荧光定量PCR检测β-葡聚糖合成相关基因,结果显示ssdid4Δ中参与合成β-葡聚糖的基因显著下调。以上结果表明Ss Did4在维持甘蔗鞭黑粉菌细胞壁完整性及胞内金属离子稳态中具有重要作用。（4）氧化应激反应结果显示,ssdid4Δ对H2O2的敏感性明显增强;细胞色素P450氧化酶基因在突变体ssdid4Δ的表达量均显著下调,表明基因Ss DID4可能通过影响细胞色素P450的表达,进而参与甘蔗鞭黑粉菌抗氧化胁迫的过程。本课题首次发现膜泡蛋白Ss Did4介导信息素的转运,且通过影响MAPK信号通路参与甘蔗鞭黑粉菌的有性配合,同时在细胞壁完整性、胞内金属离子稳态,以及在高渗透压力和氧化应激等多种逆境胁迫的应答过程中有着重要的作用。本课题的开展将为甘蔗鞭黑粉病的新型防控策略提供理论基础。
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