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目的:低强度脉冲超声波(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)因为其无创性,较安全,效果佳,操作简单以及较短的治疗周期,是研究领域公认的可促进骨愈合的物理治疗措施。LIPUS是一种强度介于30-100mW/cm2的脉冲式超声波,它能将声波转化为力学信号,并以低强度压力波的形式传递到组织中,上调细胞功能和增强组织再生。LIPUS还可以促进局部缺损部位的血液循环和血管的形成及缺损部位钙盐沉积和骨组织的改建。LIPUS已经在国内外临床上用于骨折、骨愈合不良和骨不连的治疗。近年来,国内外学者以及本课题组研究的主要目的是将LIPUS与骨支架材料结合应用于大面积骨缺损修复,为超临界骨缺损的修复治疗提供一种新的手段,而关于在“三维钛合金支架材料+LIPUS”修复骨缺损机制的研究中,首选的细胞模型尚未明确。因此在本研究中,比较LIPUS对多孔Ti6A14V材料(titanium-6aluminum-4vanadi um,Ti6A14V)内成骨诱导后骨髓间充质干细胞(osteogenic medium cultured bone marrow mesenchymal stem cells,OM-BMSCs)和小鼠前成骨细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)细胞增殖和分化产生不同影响,筛选LIPUS体外实验适宜细胞模型,为“三维钛合金支架+LIPUS”的治疗方法用于修复骨缺损的机制研究奠定基础。研究方法:1、将P3代小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行体外的成骨诱导,成骨诱导培养基:高糖培养基(H-DMEM)+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗+100nmol/L地塞米松+50μmol/L抗坏血酸磷酸酯+10mmol/Lβ_甘油脂肪酸钠,应用胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,胞外矿化结节茜素红染色测定小鼠BMSCs成骨能力。2、将OM-BMSCs、MC3T3-E1分别与多孔Ti6A14V复合培养,实验分组为OM-BMSCs+Ti6A14V+LIPUS组、OM-BMSCs+Ti6A14V 对照组、MC3T3-E1+Ti6A14V+LIPUS 组、MC3T3-E1+Ti6A14V对照组。3、在LIPUS的作用下,用扫描电子显微镜(scaning electron microscope,SEM)观察了 OM-BMSCs 和 MC3T3-E1 在多孔 Ti6A14V 上的细胞形态。4、应用 MTT 法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测LIPUS 对多孔Ti6A14V上OM-BMSCs和MC3T3-E1增殖的影响。5、应用实时定量PCR(realtime-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测 LIPUS 作用下多孔 Ti6A14V上 OM-BMSCs 和 MC3T3-E1 成骨基因 Runt 相关转录因子 2(runt-related transcription factor 2,Runx-2)、I 型胶原蛋白(collagen I,Col-I)的表达。6、应用 Western-blot印迹技术检测LIPUS作用下多孔Ti6A14V上和MC3T3-E1 Runx-2、Col-I蛋白含量。结果:1、在光学显微镜下,成骨诱导初期BMSCs的细胞形态为纺锤形,随着诱导周期的延长,细胞逐渐向四周伸展,伸出伪足与细胞相连。诱导培养14d时,细胞内分泌的ALP颗粒被染成蓝色;诱导培养三周后,茜素红染色可见细胞外橙红色的钙结节。2、SEM观察在多孔Ti6A14V上各组OM-BMSCs、MC3T3-E1细胞均伸展良好,可见细胞长入材料孔隙内部,表面不平坦,边界模糊,可见细胞伸出伪足,具有良好的生长状态。3、MTT结果显示,OM-BMSCs模型组在培养3d,5d时,超声组的细胞增殖水平高于对照组,OD值差异具有统计学意义(P<0.05);MC3T3-E1模型组在培养1d,3d,5d,7d时,超声组和对照组的OD值差异无统计学意义(P>0.05)。4、RT-PCR和Western-blot检测的结果显示,多孔Ti6A14V材料与MC3T3-E1细胞共培养模型组,超声组Runx-2,Col-I的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其中4d时超声组Runx-2的表达量明显高于对照组,差异具有显著统计学意义(P<0.01);7d时超声组Col-I的表达量明显高于对照组,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。多孔Ti6A14V材料与OM-BMSCs共培养模型组,各时间点超声组Runx2和Col-I的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:LIPUS明显上调多孔Ti6A14V内MC3T3-E1的骨向分化,但促增殖作用并不明显;相反,LIPUS对于多孔Ti6A14V内OM-BMSCs的增殖具有正向调节作用,但对于骨向分化无明显影响。因此,关于LIPUS对三维钛合金支架材料内成骨分化作用机制的研究,MC3T3-E1细胞模型较为适合。