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研究背景: 植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD）是在胚胎植入子宫前进行的最早期的产前遗传学诊断，是杜绝致病基因垂直传播的最有效方法。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）缺乏症，是世界上最常见的酶缺陷病之一，为X连锁不完全显性遗传。临床表现具有高度异质性，主要表现为溶血性贫血和以未结合胆红素升高为特点的高胆红素血症。成年患者最严重的威胁是出现急性肾衰竭，而新生儿期发病则可导致核黄疸，造成永久性神经系统损伤甚至死亡。该病是联合国卫生组织6种主要应该预防和控制的遗传病之一，亦是广东省及深圳市出生缺陷干预工程的干预病种之一。目前国内外主要通过性别选择避免有表型的胚胎移植，尚无针对G6PD基因PGD的报道。简单的性别选择并不适用于所有G6PD缺乏症夫妇，只有通过针对性的G6PD基因的检测才能最有效地阻断该基因的垂直传播，达到优生目的。故建立G6PD基因PGD诊断意义深远。 研究目的: （1）应用巢式PCR联合多重SNaPshot技术，建立稳定、快速、准确的单细胞G6PD基因诊断方法，并评估巢式PCR法在G6PD缺乏症PGD中的可行性。 （2）应用全基因组扩增（whole genome amplification,WGA）技术，联合多重SNaPshot微测序和单倍型分析，建立可监测污染和等位基因脱扣（allele drop out，ADO）发生与否的单细胞G6PD基因诊断体系，并评估该体系在G6PD缺乏症PGD中的可行性。 研究方法: （1）获取单淋巴细胞，应用巢式PCR结合多重SNaPshot技术建立对G6PD基因突变高发的Exo n2、9、11、12四个外显子上的12个突变位点的单细胞基因诊断方法。 （2）分别获取单淋细胞、单卵裂球及滋养层细胞，在 WGA技术基础上应用多重SNaPshot技术检测25个已报道的中国人群G6PD基因突变位点，并联合Xq28上6个短串联重复序列（short tandem repeat，STR）位点的单倍型分析技术及Amelogenin基因的性别诊断技术建立G6PD缺乏症PGD诊断体系。 研究结果: （1）应用多重巢式PCR结合SNaPshot技术在单细胞水平上成功建立检测Exon2、Exon9、Exon11、Exon12上12个G6PD突变位点的基因诊断方法，检测58个正常和108个杂合子单淋巴细胞，扩增效率为90.97％，ADO率为8.08%。 （2）联合应用WGA技术、SNaPshot基因分型技术、单倍型分析技术和性别诊断技术，在单细胞水平上成功建立既可扩增所有能发生突变的外显子，检测25个已报道的中国人群G6PD基因突变位点，又能同时监测污染或ADO的诊断体系。检测60个正常和96个杂合子单淋巴细胞，WGA扩增效率为94.23%；成功扩增的 WGA产物在后续基因检测的总扩增效率为89.37%，总的 ADO率为13.74%，各项基因间的扩增效率和ADO率有统计差异（P<0.05）。检测24个单卵裂球，WGA扩增效率为95.83%；成功扩增WGA产物在后续基因检测的总扩增效率为92.39%，总的ADO率为10.00%，各项基因间的扩增效率无统计差异（P>0.05）。活检8个囊胚的滋养层细胞，WGA均扩增成功，后续实验中亦未见基因扩增失败，滋养层细胞的检测结果均与对应的囊胚阳性对照一致，未见ADO发生。 （3）比较所建立的两种方法对单淋巴细胞的检测效果，巢式PCR法的扩增效率更高（90.97%v s.78.21%，P=0.001），ADO率更低（8.08%v s.19.48%，P=0.026），差异均有统计学意义。WGA法可扩增检测更多的外显子和突变位点，并可在G6PD基因分型的同时，监测是否存在污染或ADO的可能性，诊断结果更为准确可靠。 结论: （1）所建立的多重巢式PCR结合SNaPshot技术具有扩增效率高、ADO率低、时效性好和成本低等优点，可在单细胞水平上快速、准确地检测12个G6PD基因突变位点。 （2）在单细胞水平上联合应用WGA技术、SNaPshot基因分型技术、性别诊断技术和单倍型分析技术所建立的G6PD基因诊断体系，适用于25个G6PD基因突变位点的PGD。虽然扩增效率较低和ADO率较高，但可通过单倍型分析的结果来提示是否存在污染或ADO的可能性，从最大程度上保证诊断结果的可靠性，减少PGD的误诊率。 （3）通过进行囊胚期胚胎的滋养层细胞活检，获得多个细胞进行PGD，可有效弥补 WGA法在单细胞水平上扩增率较低、ADO率较高的不足，有望取代传统的性别选择，实现对G6PD缺乏症患者真正意义上的PGD。