论文部分内容阅读
草甘膦(Glyphosate)作为一种有机磷类除草剂,具有广谱、高效、低毒、易分解等特点,在全球范围内被广泛使用。其作用机制主要是通过抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸盐(EPSP)合成酶的活性,抑制芳香氨基酸的生物合成,使植物中蛋白质合成受阻,从而导致植物的死亡。在对农业生产带来巨大效益的同时,也对生态环境产生了一定的负面影响,农业生产中残留的大量草甘膦通过人为或自然因素进入水体生态系统,对其中的藻类、鱼类、两栖类等非靶标生物产生潜在的危害。本论文选择中国南方分布较广泛的农田两栖类物种饰纹姬蛙Microhyla fissipes蝌蚪为研究对象,进行不同浓度的草甘膦暴露实验,以活动行为、生长发育、组织结构、生理生化及基因表达等变化作为生物学指标,对草甘膦对饰纹姬蛙蝌蚪产生的毒性效应进行综合性评价,以期为草甘膦的合理使用及生物安全性监测提供初步的试验依据。研究结果如下: (1)开展了草甘膦对饰纹姬蛙蝌蚪的致死性毒理研究。结果表明,一定浓度的草甘膦对饰纹姬蛙蝌蚪能产生致死效应,其96h的半致死浓度(LC50)为155.4mg/L。在此基础上,设计10d的草甘膦暴露实验(浓度分别为0mg/L、60mg/L、90mg/L和120mg/L),发现饰纹姬蛙蝌蚪的死亡率呈现明显的“时间-剂量”效应,在10d暴露结束时,蝌蚪的存活率分别为100%、88%、25%和2%。同时,观察到草甘膦处理的蝌蚪更倾向于集中分布在饲养盒的边缘。对比了60mg/L、90mg/L草甘膦处理10d后的蝌蚪在肝脏组织形态学上与对照组的差异。结果表明,与对照组相比,处理组肝脏黑色素增多,肝细胞出现一定程度的变形,胞质更为疏松。 (2)开展了草甘膦对饰纹姬蛙蝌蚪的非致死性毒理研究。结果表明,60mg/L、90mg/L草甘膦暴露10d将显著抑制蝌蚪的生长,具体表现为蝌蚪的体质量、全长、头体长、尾长、体宽、眼间距等参数均低于对照组,这些参数的改变可能进一步降低蝌蚪的捕食和运动能力。进一步对比了60mg/L、90mg/L草甘膦处理10d后的蝌蚪在尾肌组织形态学上与对照组的差异,结果发现草甘膦处理组尾部肌纤维直径变小,整体表现为尾部肌肉附着量随处理浓度升高而降低,提示草甘膦可能导致饰纹姬蛙蝌蚪生长受到抑制、运动能力下降。运动能力降低可能是蝌蚪分布于饲养盒边缘的原因。 (3)为揭示草甘膦对饰纹姬蛙蝌蚪的致死机制,研究了草甘膦对饰纹姬蛙蝌蚪抗氧化防御系统的影响。结果表明,10d暴露结束后饰纹姬蛙蝌蚪体内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力随草甘膦浓度升高而逐渐升高,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量也随草甘膦浓度升高而累积,说明草甘膦处理可能导致蝌蚪体内出现氧化应激,并导致过氧化损伤,这可能是草甘膦导致蝌蚪死亡的重要原因之一。 (4)为揭示草甘膦抑制饰纹姬蛙蝌蚪生长的机制,对3种不同浓度(0mg/L、60mg/L、90mg/L)草甘膦暴露10d后的饰纹姬蛙蝌蚪进行转录组测序(Illumina,Hi-seq2000)。共获得426,250条Unigenes(N50=1371bp),注释率为41.75%。与对照组相比,在60mg/L和90mg/L处理组中分别有374(上调∶下调=78∶296)和450(上调∶下调=96∶354)个差异表达基因。GO富集分析表明,“有机氮类化合物的生物合成”途径富集了最多的差异基因,提示草甘膦处理可能激活了蝌蚪体内的有机氮代谢途径,这可能与肝脏组织形态异常相关;经KEGG富集分析后,差异基因主要分布在与“核糖体”、“溶酶体”的功能相关的通路中。值得注意的是,核糖体功能组分和肌纤维蛋白相关基因的表达在处理组中整体下调,提示草甘膦处理后的蝌蚪总蛋白及肌纤维蛋白合成能力降低,这为草甘膦导致的个体生长抑制和运动能力降低提供了直接的分子解释。 综上而言,本论文探讨了草甘膦对饰纹姬蛙蝌蚪的致死性和非致死性毒理影响及其浓度范围。其中,草甘膦导致的过氧化损伤以及肝脏对有机磷的代谢负担均可能是蝌蚪死亡的重要原因。非致死性影响表现为蝌蚪的生长抑制和运动能力降低,草甘膦介导的核糖体组分及肌肉结构蛋白的转录下调可能是导致这一现象的重要机制。通过对氨基酸代谢的抑制影响蛋白合成是草甘膦的主要除草机制,而本文首次从分子水平揭示了草甘膦可能通过直接影响蛋白质合成工厂——核糖体的转录表达而抑制动物的生长。以上结果对于除草剂的安全性评估以及功能改良等方面均具有重要参考价值。