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目的乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的身体健康。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是一种高度侵袭性的乳腺癌亚型,因为缺乏有效的治疗靶点,转移和复发率较高,所以比其他乳腺癌亚型预后更差。临床上迫切需要找到确切的治疗靶点以开发出更加有效的治疗TNBC的药物。研究发现TNBC中存在异常激活的信号通路,包括Notch信号通路和Hedgehog信号通路,它们对肿瘤的发生发展均起着至关重要的作用,而且在一些恶性肿瘤中,Notch信号通路和Hedgehog信号通路之间存在着交互对话,所以本研究的目的是,探讨沉默三阴性乳腺癌中Notch1基因后下游靶基因Hes1的表达情况,及对Hedgehog信号通路中关键分子Smo、Gli1表达的影响。方法培养三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞至3-5代,将细胞分为3组,即实验组、阴性对照组和空白对照组,分别应用Notch1-siRNA转染实验组细胞,应用NC-siRNA转染阴性对照组细胞,空白对照组细胞不做处理。细胞转染后,倒置显微镜下观察细胞的形态变化和生长情况;荧光显微镜下观察各组细胞的转染情况;用RT-PCR检测Notch1基因的转染效果,并在购买的3条Notch1-siRNA中统计筛选出沉默效率最高的一条siRNA用于后续转染实验;用RT-PCR方法检测Notch1、下游靶基因Hes1以及Hedgehog信号通路中Smo、Gli1的mRNA表达情况;应用Western Blot方法检测Notch1、Hes1以及Hedgehog信号通路中Smo、Gli1的蛋白表达情况。结果1细胞转染后,倒置显微镜下观察,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组的MDA-MB-231细胞数量变少,部分细胞由长梭形变为圆形,细胞体积减小。2细胞转染后,荧光显微镜下观察,与空白对照组相比,阴性对照组有点状散在的少量荧光细胞,而购买的3条Notch1-siRNA分别转染的实验组中均有较多荧光细胞出现,其中转染Notch1-homo-5723的实验组中出现的荧光细胞最多,估测转染效果最好。3 RT-PCR方法筛选有效小干扰RNA结果显示:转染Notch1-siRNA后,检测各组中Notch1基因的mRNA表达情况并进行统计分析,阴性对照组(即转染NC-siRNA)转染率为1%,实验组中,Notch1-homo-6950的转染率为44%,Notch1-homo-5723的沉默效果稳定,转染率为83%,Notch1-homo-4757的转染率为36%。实验组中3条siRNA分别与空白对照组、阴性对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。最终确定Notch1-homo-5723为最有效Notch1-siRNA,并将其用于后续实验。4细胞转染24小时后,RT-PCR方法检测到实验组中Notch1、Hes1、Smo、Gli1的mRNA表达水平均有明显降低,分别与空白对照组、阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。细胞转染48小时后,Western Blot方法检测到实验组中的Notch1、Hes1、Smo、Gli1的蛋白表达水平均有明显降低,分别与空白对照组、阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1利用siRNA沉默体外三阴性乳腺癌细胞的Notch1基因后,Notch1及下游靶基因Hes1表达均明显下降,表明Hes1是Notch信号通路的敏感靶基因。2利用Notch1-siRNA沉默Notch信号通路后,Hedgehog信号通路中Smo及Gli1表达下降,表明在三阴性乳腺癌中,沉默Notch信号通路会影响Hedgehog信号通路的活性。