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miR-202属于microRNA中与细胞分化相关的let-7家族成员,是一种在脊椎动物中高度保守且特异存在的miRNA,广泛参与了生物体中诸多关键的生理、病理过程。近年来,关于miR-202功能的研究主要聚集在两方面,一是作为肿瘤抑制因子,参与调控某些恶性癌变的生理过程;二是影响性腺的分化和发育。在癌症相关的研究中发现miR-202与细胞的增殖分化有关,但对于其在胚胎发育过程中的功能依然是未知的。胚胎的早期发育过程非常复杂,包括了细胞分裂与分化、细胞运动、胚层形成和器官形成等生物过程。这些过程需要众多信号通路之间的相互协调、共同作用,一起控制整个发育过程的正常进行。斑马鱼是模式生物,它繁殖容易,发育快、体外受精、体外发育、胚胎透明等优点有利于研究胚胎发育过程。斑马鱼的胚胎形成过程中,囊胚期和外包时期是胚层细胞协同运作和合子基因表达的关键时期,其调控网络复杂且机制尚不明确。在实验室前期的研究中发现miR-202在斑马鱼早期胚胎发育中各个时期均具有持续的表达。采用注射反义核苷酸的方法阻断miR-202-3p的表达会引起斑马鱼胚胎发育在囊胚过渡时期停滞并最终死亡。进一步通过CRISPR-cas9系统在基因组上对miR-202所在的区域进行片段敲除,发现miR-202突变体纯合子胚胎出现了与反义抑制miR-202表达类似的胚胎发育异常,因而我们初步判断miR-202是一个对斑马鱼早期胚胎发育非常重要的miRNA。以前期的研究结果为基础,本文对miR-202在胚胎发育过程中的具体功能进行进一步实验研究并探讨其作用机制。我们发现在胚胎发育早期miR-202-3p的表达量较低,在成鱼卵母细胞中却大量存在,miR-202-3p开始合子型表达的时期与miR-202突变纯合子发育异常的时间点基本相符。实验对敲除miR-202的F2代斑马鱼从胚胎发育到成鱼进行了表型和基因型上的观察统计分析,发现miR-202纯合突变体在胚胎发育上出现剧烈的发育异常,尤其是在3.5hpf的囊胚原肠胚过渡时期,纯合子胚胎出现卵裂球破碎不均、发育过程延缓和发育异常。F2代杂合子则没有观察到胚胎发育异常。F2代成鱼中没有发现纯合子,证明了miR-202的缺失导致斑马鱼在早期发育过程中死亡。对于敲除miR-202后胚胎无法正常渡过早期发育阶段的现象,实验进行了F2代的转录组测序和蛋白组测序,进而比较分析miR-202缺失纯合胚胎与正常胚胎在3.5hpf时期的基因表达和蛋白表达差异。我们发现有400多个基因发生了差异表达,我们将差异基因对比其在正常发育过程中的0hpf到3.5hpf的表达量变化,分成三类在胚胎中异常调节的情况:表达量增加不足、表达量增加过量和表达量降低不足。这些差异基因分别富集到了与细胞凋亡、核糖体、氧化磷酸化、细胞连接等相关的通路;蛋白组分析中鉴定到了诸多核糖体相关蛋白在纯合胚胎中明显减少。说明miR-202的缺失造成了一些其调控的关键基因的异常表达,进而导致了对胚胎发育过程重要的通路出现异常调控。进一步检测实验发现在miR-202纯合突变体斑马鱼胚胎中发生了囊胚细胞凋亡、蛋白翻译障碍、细胞连接减弱、ROS等一系列异常效应,结合转录组的分析结果我们推测,在囊胚分裂时期,miR-202的缺失引起凋亡相关基因的异常过量的调节,导致了囊胚细胞的凋亡。凋亡进一步抑制了核糖体活性以及蛋白翻译功能,其过程伴随ROS的激活以及细胞连接的异常调节,最终导致了胚胎发育的异常甚至死亡。本实验证明miR-202参与调控斑马鱼胚胎发生发育过程中一些重要的通路,对胚胎的正常发育至关重要。实验探究了miR-202在胚胎发育过程中的一些调控功能并挖掘其调控过程,为进一步发掘miR-202在斑马鱼胚胎发育的早期阶段发挥功能的分子机制奠定基础。