象草PpMYB60转录因子基因的克隆与功能分析

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hufei1984
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象草(Pennisetum purpureum)是一种具有较高生物量生产力的新型能源植物。然而,木质素的存在极大地限制了象草细胞壁降解利用。为了能更好的开发利用象草,本研究克隆得到1个象草转录因子,并对它进行一系列的功能分析。本文研究结果如下:(1)根据象草转录组拼接序列,设计引物MYB-F和MYB-R,以象草cDNA为模板,扩增得到一段长度为873bp MYB转录因子CDS序列,将其命名为PpMYB60,GenBank ID:MG149570。(2)通过分析发现,PpMYB60含有291个氨基酸,总分子量为31.81KDa,不稳定系数和亲水性平均值(GRAVY)分别是51.42和-0.407。在PpMYB60蛋白结构中N端含有一个高度保守结构域SANT,更进一步对其氨基酸进行多重序列比对和进化分析,PpMYB60是R2R3 MYB类转录因子的成员之一。(3)构建了酵母诱饵载体pGBKT7-PpMYB60,并转化到酵母感受态中,发现其能在一缺培养基上生长,无法在三缺培养基上生长。表明PpMYB60基因没有很强的转录自激活性。(4)构建植物过表达载体pCUbi1390-PpMYB60,转化到农杆菌后,通过叶盘法转化野生型烟草。经鉴定,得到3个表达水平较高的转基因株系。转基因植株的表型与野生型烟草相比,出现矮化、茎节短、叶片发黄等现象。通过溴乙酰法测定转基因烟草、野生型烟草茎部和叶柄的木质素含量,发现转基因的烟草茎和叶柄的木质素含量极显著高于野生型(P<0.01)。尤其是OE5植株的叶柄及茎部的木质素含量较野生型分别上调了27.87%和6.90%。同时通过徒手切片对茎部木质素进行间苯三酚染色,发现转基因茎部木质部细胞数量多于野生型,木质部细胞间的排列十分紧密,而野生型烟草木质部细胞数量少、直径小且排列疏松。结果表明PpMYB60基因能上调木质素合成。(5)对转基因烟草进行实时荧光定量PCR实验,检测木质素合成途径中四个关键酶基因CCoAOMT、CCR、CAD和4CL的表达量。结果发现转基因烟草的木质素合成相关基因表达量极显著高于野生型(P<0.01)。CCoAOMT、CCR、CAD和4CL基因的表达量分别为野生型的4.87、2.84、2.45和2.46倍。结果说明过量表达PpMYB60上调了下游CCoAOMT、CCR、CAD和4CL基因的表达,从而上调转基因烟草的木质素水平。此外,用100μmol/L ABA和GA分别处理转基因植株后发现,随着处理时间加长木质素合成相关基因(CCoAOMT、CCR、CAD和4CL)表达量大部分呈现先增后减的趋势。(6)构建了以LUC以及REN为报告基因的双荧光素酶报告基因检测PpCCoAOMTPro-LUC、PpCCRPro-LUC、PpCADPro-LUC、Pp4CLPro-LUC载体和PpMYB60-SK载体,通过瞬转烟草后测定荧光值。结果显示实验组的LUC/REN的比值极显著高于对照组(P<0.01),尤其是PpMYB60-SK+PpCCoAOMTPro-LUC的比值高于对照组28.17倍。发现转录因子PpMYB60与PpCCoAOMTPro、PpCCRPro、PpCADPro、Pp4CLPro有明显的互作,且能激活PpCCoAOMTPro、PpCCRPro、PpCADPro、Pp4CLPro的活性。结果表明转录因子PpMYB60可以与上调木质素关健酶基因的启动子的活性,增强这些关键酶基因的表达,进而上调木质素水平。
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