质粒介导的高水平替加环素耐药基因tet（X4）的广泛流行和传播对人类健康及动物源性食品安全造成了极大的威胁。IncX1型质粒是tet（X4）常见的载体之一,然而,目前对于tet（X4）与IncX1型质粒的成功组合并广泛传播的分子机制尚不清楚。由于抗性强加给细菌细胞的潜在适应性代价是影响耐药菌进化传播的重要因素之一。已有研究表明,组蛋白样核结构蛋白H-NS能够调节质粒对细菌造成的适应性代价。因此,本论文以临床 IncX1 型tet（X4）阳性（IncX1-tet（X4））质粒 pRF14-1、pSC4R 及 pHS14-2为研究对象,它们都编码H-NS蛋白,基于前期的数据分析,评价tet（X4）阳性质粒对不同宿主菌的适应性代价以及hns表达量与宿主菌适应性之间的关系,揭示IncX1-tet（X4）质粒的广泛传播原因及内在机制。首先,对NCBI数据库中tet（X4）阳性质粒序列进行分析发现,单复制子类型质粒有18个,其中13个为IncX1型,并且IncX1型质粒中将近一半的质粒都编码H-NS蛋白。接着,为探究编码H-NS的IncX1-tet（X4）质粒的流行机制,通过生长曲线的测定、体外竞争实验、生物膜形成能力测定实验、运动性实验、毒力实验及质粒接合频率的测定等方法,对临床IncX1-tet（X4）质粒在宿主菌中的适应性代价进行了分析。结果表明,编码H-NS的IncX1-tetX4)质粒的适应性代价普遍较低,即质粒宿主菌的相对适应性普遍接近于1,部分质粒甚至有增强毒力、生物膜形成能力等适应性优势。因此,可以猜测IncX1-tet（X4）质粒的广泛流行归功于它们具有更低的适应性代价,并且H-NS可能在其中起到了关键作用。随后,为进一步分析编码H-NS蛋白的IncX1-tet（X4）质粒的特性,通过体内竞争、质粒传代实验以及传代后的体外竞争等实验方法,对这些质粒的体内外稳定性进行了探索。结果表明,该类质粒不仅体外适应性代价低,更重要的是体内适应性普遍好于体外,这证实了更低的体内外适应性代价是IncX1-tet（X4）质粒成功组合并流行的重要因素之一。此外,传代结果表明,质粒pSC4R和质粒pHS14-2到第50代时仍能稳定存在,质粒丢失率小于10%,并且传代过程中,质粒并未对宿主菌造成相应的适应性代价;而质粒pRF14-1到第50代时,丢失率高达60%,但该质粒的适应性代价在传代过程中得到了补偿,说明质粒pRF14-1在传代过程中可能发生了补偿性进化,提高了质粒宿主菌的适应性。最后,通过基因敲除、回补实验、RT-qPCR等实验方法,研究了 H-NS与质粒适应性代价之间的关系。结果发现,当导入质粒pCE2::hns时,能够显著提高不携带hns的IncX1-tet（X4）质粒pRF55-1的适应性,表明H-NS介导了质粒宿主菌适应性的恢复。随后的RT-qPCR实验表明质粒的适应性代价与hns的表达量呈负相关,并且对于高代价的质粒来说,hns和tet（X4）表达量呈现巨大差异,hns的表达量显著降低。这表明更高的hns表达量有助于减轻质粒对宿主菌造成的适应性代价,而质粒高代价的产生可能是由于hns表达量不足而未能完全抑制tet（X4）的表达所导致的。综上所述,本研究发现质粒编码的H-NS蛋白能够提高携带tet（X4）的IncX1型质粒宿主菌的适应性,为研究tet（X4）抗性质粒在人、动物和环境中的流行传播提供了新的见解。