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脑缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxicpreconditioning，I/HPC)是脑组织对缺血/低氧刺激产生的一种内源性保护现象，即预先给予轻、中度间断性缺血/低氧刺激，神经细胞会对随后发生的重度持续性缺血/低氧产生较强的耐受能力。这种现象最早由美国学者Murry等于1986年在心脏上发现，而脑I/HPC则最早由Kitagawa等人于1990年报道，是神经组织对低氧刺激产生的一种内源性保护措施，脑I/HPC的发现为临床上防治脑缺血/低氧性损伤或疾病开辟了新的思路。因此，有关脑I/HPC机制的研究一直是近年国内外学者关注的热点问题，但迄今为止其确切的发生发展机制尚未明确。近年来，参与调节I/HPC的信号传递系统已成为人们研究的新热点。蛋白激酶A(PKA)是依赖于cAMP的丝/苏氨酸蛋白激酶，是重要的信号传导途径之一，广泛参与许多生命过程，如生长、分化、肿瘤发生、细胞凋亡和细胞周期调控等。一般认为，cAMP/PKA通路活化可以促进细胞分化、凋亡和抑制增殖。PKA对神经元的存活与生长，以及突触的可塑性和长期记忆的形成中起着重要的正调节作用。在中枢神经系统中，PKA的活性对于神经营养因子(neurotrophin)依赖的神经元存活与生长是必需的。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)最早是由美国科学家Montrminy(1987)和Yamamoto(1988)等在研究基因转录调控时，分离纯化得到的一种具有选择特异性结合cAMP反应元件(CRE)的核蛋白。CREB分子是多种蛋白激酶作用的底物，最早被确认的激酶是PKA。CREB作为核转录因子家族中的一员，是核内的第三信使，在神经系统应激性损伤(如缺血/低氧、紫外线照射等)中，活化(磷酸化)的CREB可直接或间接激活相关基因转录，进而表达某些蛋白分子(如c-Fos、Jun-B、bcl-2等)和神经营养因子(如NGF、BDNF等)。这些基因产物调节着神经元在应激性损伤后再生、存活及修复，从而为神经元提供了保护。因此，探讨PKA/CREB在脑I/HPC发生发展过程中的作用，对进一步明确脑I/HPC的神经保护机制是非常有意义的。
1本实验在我们已建小鼠整体低氧预适应模型基础上，将成年健康雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照组(H0)、低氧暴露1次(H1)、重复性低氧2、3和4次(低氧预适应早期，H2-H4)，以及重复性低氧5和6次(4次重复性低氧小鼠恢复24h后，再进行第5和6次低氧刺激，即H5和H6为延迟性低氧预适应)等7组。实验应用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)等生化技术，并结合GelDoc凝胶成像系统，定量观察了早期低氧预适应和延迟性低氧预适应小鼠大脑皮层和海马组织内PKA及CREB的磷酸化水平和蛋白表达量的变化。此外，本实验还应用免疫组织化学方法观察了低氧预适应小鼠大脑皮层组织内PKA及CREB在神经细胞内分布的情况。所得结果如下：
①实验发现，随着低氧次数的增多，小鼠低氧耐受时间增加。与只经过1次低氧预处理的H1组(17.88±2.19min，n=6)小鼠相比，H2(31.30±5.99，p＜0.05，n=6)、H3(33.55±6.82，p＞0.05，n=6)和H4(35.30±5.93min，p＜0.05，n=6)组等早期低氧预适应小鼠的低氧耐受时间明显增高；而H5(20.29±0.42，n=7)和H6(27.14±1.06，n=7)等延迟性低氧预适应组小鼠的低氧耐受时间与H1组比较，虽有一定的增高，但并不象早期预适应阶段那样明显。提示，我们所测低氧耐受时间的增高可能只与一些细胞信号转导通路中的信号蛋白激活有关，如蛋白激酶和磷酸酶的激活；而与一些基因表达和蛋白质合成等长效变化无关。
②定量分析低氧预适应小鼠脑组织内PKA及CREB磷酸化水平变化发现，在低氧预适应早期的形成过程中，随低氧次数(H1-H4)或耐受时间的增加，小鼠海马和皮层组织内CREB磷酸化水平显著增高(vsH0：p＜0.05，n=6)，而PKA磷酸化水平则无明显的改变；在延迟性低氧预适应(H5和H6)形成过程中，PKA及CREB磷酸化水平均无明显变化。提示，CREB的激活可能参与了早期脑低氧预适应的发生过程。
③定量分析脑组织内PKA及CREB蛋白表达量发现，在低氧预适应早期形成过程中，随低氧次数(H1-H4)或耐受时间的增加，小鼠海马和皮层组织内PKA及CREB蛋白表达量均无明显的改变；同样，在延迟性低氧预适应(H5和H6)发展过程中，小鼠海马和皮层组织内PKA及CREB特异性蛋白表达水平也无明显的改变。提示，PKA及CREB并不以蛋白表达量改变的形式参与脑低氧预适应的发生发展过程。
④应用免疫组织化学方法发现，重复性低氧暴露后，小鼠大脑皮层组织内p-CREB阳性颗粒明显增加，而PKA的变化不明显。这一形态学结果进一步支持上述蛋白印迹结果，即CREB磷酸化水平在脑低氧预适应早期形成过程中明显增高。
总之，本项工作为国际上第一次对PKA/CREB磷酸化水平和蛋白表达量在小鼠脑I/HPC发生发展过程中的变化进行系统地探讨。发现：①CREB的激活可能参与了早期脑I/HPC的发生发展过程；②PKA及CREB并不以蛋白表达量改变的形式参与脑I/HPC的发生发展过程。所获实验结果不仅为我们今后深入探讨PKA及CREB在脑I/HPC发生发展过程中的作用奠定了良好的工作基础，而且可能为将来临床上制定缺血/低氧性脑损伤的防治新策略或相关药物开发提供了实验依据。