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RNA干扰(RNA interference,RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象。是细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double-strand RNA)时,使同源mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。Brummekamp等人构建了一个可以在细胞内转录产生siRNA的载体系统,同样具有RNA干扰作用,这些发现为研究基因表达和抑制病毒感染等方面开辟了一个新的领域。 在过去几年时间里,RNAi已广泛用于抗病毒感染的研究中。有多篇论文报告利用RNAi抑制病毒复制,如脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、人免疫缺损病毒(HIV-1)、兽棚病毒flock house virus(FHS)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、登革病毒(deague virus)、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒(influenza virus)、乙型肝炎病毒(HBV)、乳头瘤病毒(HPV)、冠状病毒(SARS-COV)等。利用RNAi在细胞水平抑制病毒复制的研究取得了很好的结果,在动物上进行利用RNAi的抗病毒研究,如钟南山等人在猴子身上进行了RNA干扰抗SARS-COV的研究,也取得很好的结果。在以上的研究中大多数是用的人工合成21nt的dsRNA。然而基于载体表达siRNA的RNA干扰技术在最近的研究更多的被人们采用,每个载体表达特异的siRNA能降解特异的靶标。 已有报道HIV—1通过其基因的突变逃脱RNA干扰作用,毫无疑问,HBV基因的突变也会导致病毒对RNA干扰的抗性,要对付病毒逃避RNA干扰的这种机制,通常采取的策略是将RNA干扰作用的靶位点选择在病毒基因的保守区即不易发生突变的区域,在本研究中我们采用的策略是利用同一个载体同时表达两个siRNA针对HBV的S和X基因的方法,以克服病毒利用突变逃避RNA干扰作用。 本研究采用载体表达siRNA的方法,进行RNA干扰抑制HBV基因表达和复制的研究。我们设计合成一对64nt的单链DNA片段,其中包含有19nt序列是与HBV基因同源的,即siRNA作用的靶位点,两条单链DNA链退火可以互补形成双链DNA片段,并可以克隆到pSliencer 2.1-U6质粒上的Bam H Ⅰ—Hind Ⅲ位点。为了获得一个快速筛选载体pLucF,可以将靶基因序列如HBS或HBX基因与报道