本研究基于构建的海蜇(Rhopilema esculentum)转录组文库,通过生物信息学方法分析和深入挖掘,解析了海蜇Wnt信号通路3个关键基因Wnt3、Frizzled5/8和β-catenin的cDNA和基因组结构,通过荧光实时定量PCR和整体原位杂交技术分析,进一步阐明了这些基因在海蜇无性繁殖过程的表达规律,进而为了解海蜇无性繁殖的分子调控机制提供参考和依据,以下为获得的主要研究结果:1.海蜇转录组文库的构建及生物信息学分析以454 GS FLX技术对半板海蜇转录组文库进行测序,获得了 58万多条序列,其中总长度约240 Mb,平均长度409.2 bp。去除引物和低质量的序列(<100bp),共获得49万条高质量的ESTs序列。组装了 37628条功能基因,并将其归类于海蜇的细胞定位,分子功能和生物过程等功能,其中参与细胞定位,分子功能和生物过程的功能基因分别占库容的30.88%,31.45%和37.67%。比较转录组学方法分析发现海蜇含有己发现的大部分Wnt信号通路的关键基因,除Wntl0外,海蜇拥有12个Wnt家族基因的ESTs序列、5个Frizzed ESTs序列和两个β-catenin ESTs序列。2.海蜇Wnt3基因的克隆、基因组结构与表达首次克隆到的海蜇Wnt3(ReWnt3)基因的cDNA全长为2074 bp,其中开放阅读框为1080 bp,编码长度为360个氨基酸的多肽,内含有23个高度保守的半胱氨酸。ReWnt3基因组全长为4704bp,由5个外显子和4个内含子组成,其结构与水螅Wnt3基本相似。多序列比对显示,ReWnt3与其他刺胞动物门的氨基酸序列具有较高的一致性,其中与半球美螅水母C.hemisphaerica同源性达到32.8%。系统进化分析显示,脊椎动物的Wnt3和Wnt3a家族分别形成两个姊妹群,然后与半索动物囊舌虫刺胞聚为一支,最后与刺胞动物门的Wnt3聚成一个类群,形成了从低等到高等动物,从简单到复杂的Wnt3逐级进化模式。荧光实时定量PCR分析发现ReWnt3广泛表达于海蜇无性繁殖四个不同过程,并随着发育过程的不同其表达量而有所差异,其中横裂体的mRNA表达量最高。3.海蜇Frizzled 5/8基因的克隆、基因组结构与表达首次克隆到的海蜇Frizzled 5/8基因(ReFzd 5/8)的cDNA全长为2166 bp,其中开放阅读框长1701 bp,编码567个氨基酸组成的多肽。SMART分析表明,ReFzd 5/8基因符合Frizzled家族的结构特点,即包含一个位于N-末端富含10个保守半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域(CRD)、一个七个跨膜片段的跨膜结构域、以及一个信号肽(21个氨基酸)。ReFzd5/8基因组无内含子。BLAST分析结果表明,ReFzd 5/8的氨基酸序列与来自刺胞动物门的半球美螅水母Clytia heanisphaeric 和大乳头水螅Hydra,magnipapillata的Frrizled具有很高的同源性。系统进化分析表明,ReFzd5/8首先和来自刺胞动物门的海葵Fzd聚类在一起,然后与来自不同物种的Fzd5和8基因聚类在一起。实时荧光定量PCR结果显示,在海蜇无性繁殖的4个不同发育阶段均发现了 ReFzd 5/8基因的表达,其表达量随着发育阶段的不同有明显差异。其中横裂体的相对表达水平最高,其表达量分别是螅状体、稚水母和碟状体的6.90、4.35和1.74倍。整体原位杂交技术发现螅状体的触手和基座存在ReFzd 5/8基因的表达。4.海蜇β-catenin基因的克隆与表达首次克隆到的海蜇β-catenin(ReBcn)基因的全长cDNA为3035 bp,其中编码区为2451bp,编码了由816个氨基酸组成的多肽。SMART分析表明,ReBcn基因含有一个卷曲螺旋的结构域,但不存在信号肽。BLAST分析表明,ReBcn与来自刺胞动物门的半球美螅水母Clytia hemisphaerica、大乳头水螅Hydra magnipapillata、Podocoryna carnea、海洋水螅 Hydractinia echinata 和普通水螅Hydra vulgris具有很高的同源性,其氨基酸序列一致性都在74%以上。利用N-J法构建β-catenin系统树显示,ReBcn与刺胞动物门的ββ-catenin聚类在一起,形成了刺胞动物门ββ-catenin的独立分支。通过RT-PCR技术发现,在海蜇无性繁殖的四个不同阶段均存在着ReBcn的表达,相比其他不同发育阶段,碟状体的表达量最多。