Th17细胞，是一种新发现的能够产生白介素-17(IL-17)的T辅助细胞亚型。Th17细胞具有高度的促炎症性，并能够诱导严重的自身免疫。大量证据表明IL-17与多种自身免疫性疾病的病理相关，包括类风湿性关节炎、银屑病、系统性红斑狼疮和克隆氏疾病。在动物模型关节炎中，用抗体或可溶性的受体阻断IL-17，能够缓解炎性症状。 磷酸二酯酶是由催化环磷腺苷(cAMP)和环磷鸟苷(cGMP)水解成相应的一磷酸盐的酶蛋白超家族组成，在多种生理功能中起重要作用。磷酸二酯酶抑制剂在多种炎症性疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、变应性鼻炎和异位性皮炎中有效。选择性磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂(PDE4)通过抑制cAMP的水解而升高细胞内的cAMP水平，在临床上已经被证明是呼吸道炎症性疾病的一种抗炎药。在动物模型中，关节炎和脓毒症也是磷酸二酯酶抑制剂的适应症。 在目前的研究中，我们观察了选择性磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂Zl-n-91对Th17细胞的作用。正常志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)用抗CD3(anti-CD3)和抗CD28(anti-CD28)单克隆抗体刺激，加或不加Zl-n-91。IL-17水平用ELISA和RT-PCR的方法检测。我们的实验结果表明加入Zl-n-91能够抑制anti-CD3／anti-CD28诱导的IL-17的产生，且这一抑制作用呈剂量依赖效应。相应的半数抑制量(即抑制最大量的一半)在这个范围内：50-100μM。Zl-n-91同时抑制IL-17mRNA表达水平。纯化的CD4+T细胞用anti-CD3／anti-CD28刺激，加或不加Z1-n-91，结果显示，Z1-n-91在转录和翻译水平上抑制IL-17的产生和表达。流式结果表明Zl-n-91通过抑制CD4+T细胞活化、增殖和分裂来抑制记忆性Thl7细胞产生IL-17。我们的结果表明Zl-n-91可能在IL-17相关的自身免疫性疾病的治疗中具有重大的应用前景。 目的 探讨选择性磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂Zl-n-91对记忆性Th17细胞产生IL-17的作用及其作用机制。 方法 (1)肝素抗凝血用密度梯度离心法分离，获得正常人PBMCs，加anti-CD3／anti-CD28共培养细胞，再加入不同浓度的Zl-n-91，用ELISA方法检测培养上清中IL-17和IFN-γ产生的量，观察Zl-n-91对PBMCs产牛IL-17和IFN-γ的影响。 (2)用磁珠分选法分离正常人PBMCs中的CD4+T细胞，用anti-CD3预先包被96孔板，再加入anti-CD28和不同浓度的Zl-n-91，孵育3天后用ELISA方法检测培养上清中IL-17和IFN-γ产生的量，观察Zl-n-91对CD4+T细胞产生IL-17和IFN-γ的作用。 (3)用六孔板培养PBMCs，并加入anti-CD3／anti-CD28刺激细胞，或者用anti-CD3预先包被6孔板，再加入anti-CD28共培养磁珠分选出来的纯化CD4+T细胞，加或不加Zl-n-91。孵育20h后收集细胞，用TRIzol裂解细胞，按照美国Invitrogen公司RNA提取的试剂盒提取总的RNA，再按照逆转录试剂盒的操作流程将总的RNA逆转录为cDNA，最后利用PCR技术将cDNA中的目的基因扩增。通过琼脂糖凝胶电泳可以将扩增的目的基因以条带的方式半定量显示。 (4)PBMCs加入anti-CD3／anti-CD28共培养，加或不加Zl-n-91。使用流式细胞术在单个细胞水平上评价Zl-n-91对细胞内细胞因子IL-17、IFN-γ和IL-2及T淋巴细胞表面活化分子CD25、CD69表达的影响。 (5)PBMCs用上述方法培养，3天后收集细胞，按BD PharmingenTM BrdU流式试剂盒说明书的操作流程给不同培养条件的细胞掺入BrdU，再使用流式细胞技术分析Zl-n-91对BrdU掺入的影响。 (6)按CFSE试剂盒说明书的操作流程标记PBMCs，然后按上述方法刺激培养细胞，3天后收集细胞，进行表面染色，再使用流式细胞技术分析Zl-n-91对细胞分裂的影响。 结果 (1)Zl-n-91能够抑制anti-CD3／anti-CD28诱导的正常人PBMCs IL-17的产生，且这一效应呈剂量依赖性。它不是IL-17特异性的抑制剂，除了抑制IL-17，它还抑制IFN-γ的产生。 (2)对PBMCs，RT-PCR结果显示，Zl-n-91同时能在转录水平上抑制IL-17的基因转录。即Zl-n-91对IL-17抑制作用在转录和翻译水平是一致的。 (3)T细胞亚群分析的结果表明，IL-17主要由CD4+T淋巴细胞表达，而Zl-n-91能够抑制CD4+T淋巴细胞IL-17、IFN-γ和IL-2的表达。重要的是，Zl-n-91能够抑制记忆性Th17细胞亚群IL-17的表达，而对IFN-γ,则同时抑制初始和记忆性T细胞IFN-γ的表达。更重要的是，Zl-n-91在加入的每个时间点都有抑制作用，并且在细胞被活化1h后加入仍然有抑制作用。 (4)Zl-n-91能够直接作用于CD4+T细胞，在翻译水平上，它能抑制anti-CD3／anti-CD28诱导的正常人纯化的CD4+T淋巴细胞IL-17和IFN-γ的产生，并且呈剂量依赖性。在转录水平上，其作用与翻译水平上相一致，它能够抑制IL-17的基因转录，降低IL-17mRNA的表达水平。 (5)Zl-n-91能够抑制anti-CD3／anti-CD28诱导的CD4+T细胞表面CD25和CD69的表达，并且Zl-n-91能够抑制CD4+T淋巴细胞BrdU的掺入并且降低由CFSE标记的CD4+T细胞的分裂次数，即Zl-n-91能够抑制anti-CD3／anti-CD28诱导的CD4+T细胞的活化、增殖和分裂。 结论 本研究证明了Zl-n-91能够以剂量依赖方式抑制正常人PBMCs中IL-17和IFN-γ的产生。同时在基因转录水平上抑制IL-17mRNA的表达。流式结果分析显示Zl-n-91抑制CD4+T淋巴细胞IL-17、IFN-γ和IL-2的表达。Zl-n-91在加入的每个时间点都能抑制记忆性Th17细胞IL-17的表达，同时抑制初始和记忆细胞IFN-γ的表达。进一步研究表明Zl-n-91能够直接作用于纯化的CD4+T淋巴细胞，在转录和翻译水平上抑制CD4+T淋巴细胞IL-17的产生。流式结果表明Zl-n-91通过抑制CD4+T细胞的活化、增殖及分裂而抑制IL-17的产生及表达。鉴于Zl-n-91对Th17细胞的作用以及IL-17在炎症反应和自身免疫性疾病中所介导的病理性反应，选择性磷酸二酯酶Ⅳ抑制剂可能在自身免疫性疾病的治疗中有广阔的应用前景。