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布鲁菌病(Brucellosis,布病)是由布鲁菌(Brucella)引起的一种人畜共患传染病,严重影响人和动物公共卫生,疫苗防治布鲁菌病是控制该病的最有效策略之一。布鲁菌是典型的胞内寄生菌,能感染巨噬细胞并使之丧失抗原提呈能力。树突细胞(DC)抗原提呈能力最强,且是唯一能够诱导细胞免疫的专职抗原提呈细胞。甘露糖受体(MR)被证明在未成熟DC表面表达,其具有酪氨酸序列,能够在早期内吞小体中进行快速循环。MR的糖识别区(CRDs)有8个,每个结合区能够结合一个糖分子。目前研究表明能与甘露糖受体结合的配体有甘露聚糖、岩藻糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、β-1,3-葡聚糖,乙酰半乳糖胺。由于甘露聚糖在机体内有靶向DC的能力,使得二者在防治布鲁菌感染方面表现出极大的应用潜力。本研究拟以DC及其靶向剂甘露聚糖作为研究对象,探索甘露聚糖作为布鲁菌多肽靶向树突细胞载体预防布鲁菌病的潜力及其诱导树突细胞分化成熟作用的分子机制。筛选靶向DC甘露糖受体的多糖。实验采用体外诱导小鼠骨髓来源树突细胞(BMDCs),与FITC荧光标记的甘露糖共孵育后分别加入D-半乳糖,D-甘露糖,L-岩藻糖,D-葡萄糖。通过荧光显微镜定性检测,流式细胞仪荧光定量检测。依据竞争性抑制原理判定与BMDCs MR亲和力最强的单糖是D-甘露糖。重复此法比较甘露糖和不同浓度的甘露聚糖与BMDCs MR亲和力差异。结果显示甘露聚糖对BMDCs MR的亲和力显著高于D-甘露糖,且有浓度依赖性。甘露聚糖衍生物作为载体增强布鲁菌多肽免疫效应分析。甘露聚糖被不同浓度高碘酸钠氧化,盐酸羟胺-电位滴定法测定氧化甘露聚糖上的醛基浓度。合成布鲁菌Omp3127(第48到第74氨基酸)多肽,另合成富含可糖基修饰的ε-NH2的赖氨酸尾部(5个KG重复)Omp3137。小鼠免疫评价两种多肽、不同反应条件、甘露糖和不同甘露聚糖衍生物修饰的糖肽复合物免疫效果。实验证明在Omp3127肽抗原尾部增加赖氨酸修饰位点的Omp3137不改变多肽免疫效果。甘露聚糖修饰Omp3137与氰基硼氢化钠端位催化甘露聚糖修饰Omp3127具有一致的免疫结果,并可以避免反应中应用毒性较高的氰化物。甘露聚糖修饰的Omp3137免疫效果优于甘露糖修饰的Omp3137;氧化型甘露聚糖(OM)修饰Omp3137能够同时引起细胞免疫和体液免疫,且提高细胞免疫尤为显著;还原型甘露聚糖(RM)修饰Omp3137显著提高体液免疫,但提高细胞免疫不显著。甘露聚糖衍生物作为免疫激活剂的验证。小鼠体内注射OM和RM,流式细胞仪检测脾DCs的CD40、CD80和CD86表达量。OM和RM分别刺激小鼠骨髓来源树突细胞(BMDCs);流式细胞仪检测BMDCs表面成熟标志因子CD40、CD80和CD86表达量;RT-PCR检测IL-12p35、IL-10和IL-4;ELISA检测IL-12p70、IL-10和IL-4。激活后的BMDCs与同种系小鼠分离的na?ve CD4+T细胞共培养,ELISA检测T细胞上清中的IL-4,IFN-γ。结果显示OM和RM体外刺激的BMDCs,OM和RM注射小鼠后分离的脾DCs,表面成熟标志因子CD40、CD80和CD86的表达量上调,其中CD80和CD86表达量上调显著。RT-PCR检测OM刺激培养4 h后的BMDCs中IL-12p35转录水平升高极显著、而IL-10和IL-4转录水平升高不显著;RM组IL-10和IL-4转录水平升高极显著,而IL-12p35转录水平升高不显著。ELISA检测OM刺激培养24 h后BMDCs培养上清中IL-12p70升高极显著,但IL-10升高不显著,没有检测到IL-4。RM刺激组的BMDCs培养上清中IL-10升高极显著,但IL-12p70升高不显著,没有检测到IL-4。OM激活的BMDCs组诱导同种系小鼠na?ve CD4+T细胞分泌IFN-γ升高极显著,而分泌IL-4升高不显著;RM激活BMDCs诱导na?ve CD4+T分泌IL-4升高显著,而IFN-γ升高不显著。实验证明了OM和RM具有树突细胞激活剂的功能,且OM在激发Th1反应有明显优势,RM主要激活Th2反应。甘露聚糖衍生物诱导树突细胞成熟的信号通路。制备RNA干扰TLR4基因BMDCs。OM和RM刺激RNA干扰TLR4基因的BMDCs,流式细胞仪检测BMDCs表面成熟标志因子CD40、CD80和CD86表达量,评价OM和RM诱导DC成熟与TLR4的关系。提取OM和RM分别刺激培养BMDCs的总蛋白,免疫组化验证细胞质MAPK信号中的p38 MAPK、ERK和JNK三条信号通路蛋白磷酸化程度。免疫组化验证细胞核转运信号中的NF-κB通路蛋白磷酸化程度。评价OM和RM刺激BMDCs成熟的细胞内信号机制。实验结果显示通过RNA干扰可显著降低BMDCs的TLR4基因表达。OM和RM体外刺激RNA干扰TLR4基因表达的BMDCs,表面成熟标志因子CD40、CD80和CD86表达上调不显著,而刺激未被沉默TLR4基因表达的BMDC,CD86表达上调显著。结果证明了OM和RM刺激BMDCs成熟与TLR4相关。OM刺激组相对未刺激组的BMDCs内p38 MAPK和JNK磷酸化程度显著(P<0.05),ERK磷酸化程度不显著;RM刺激组相对未刺激组的BMDCs内ERK磷酸化程度显著,p38MAPK和JNK磷酸化程度不显著。OM和RM相对未刺激组都能够显著提高NF-κB p65磷酸化转运。