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目的:研究尿酸(uric acid, UA)联合HBsAg负载的树突状细胞疫苗接种小鼠后产生的抗乙肝病毒(HBV)免疫效应,包括HBsAg特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤效应,T淋巴细胞增殖反应,Th1/Th2型细胞因子的分泌等。并对尿酸促进DC成熟与功能提高的机理进行探讨。方法:1.体外分离小鼠骨髓细胞,使用rmGM-CSF、rmIL-4诱导分化为DC,以UA或LPS刺激其成熟。分不同剂量尿酸组(70μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml),LPS组、RMPI-1640培养基对照组。用流式细胞仪技术检测DC细胞表面分子CD11c、CD83、CD86、IA/IE的表达,用MTT法检测DC刺激同基因小鼠T淋巴细胞的增殖反应;ELISA法测定DC上清IL-12p70的分泌水平。2.尿酸体外刺激未成熟DC 48小时,提取DC总RNA。RT-PCR方法检测TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA、IL-12p70 mRNA等的表达。3.使用尿酸或联合抑制剂( p38 MAPK抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125、NF-κB抑制剂PDTC )体外刺激未成熟DC。在0min、15 min、30 min、45 min时,分别提取DC细胞总蛋白与核蛋白。免疫印迹方法检测DC p- p38、p-ERK1/2、p-JNK、NF-κB p65表达量。分别使用SB203580、PD98059、SP600125、PDTC与尿酸联合刺激DC 48h后,收集细胞,用流式细胞仪技术检测DC细胞表面分子CD83、CD86、IA/IE的表达;收集DC培养上清,ELISA法测定IL-12p70的水平。4.DC体外负载HBsAg,联合尿酸接种正常BALB/c小鼠。尾静脉注射方式接种,DC接种数量为1×106/每只小鼠,每周接种一次,共两次。分高、中、低剂量(分别为400μg、200μg、100μg)尿酸联合HBsAg-DC组、负载或未负载HBsAg的DC单独接种组、尿酸单独接种组(200μg)及PBS对照组。同时以负载HBS28-39的DC单独或联合尿酸免疫小鼠,作为平行对照观察组。一周和两周时,以体内荧光测定CTL活性方法,用流式细胞仪检测特异性CTL活性;免疫两周时,取小鼠脾T淋巴细胞,CFSE染色,体外以HBsAg或HBS28-39刺激培养72h后,流式细胞仪测定其增殖反应;取小鼠脾淋巴细胞体外HBsAg或HBS28-39刺激培养72h后,以ELISA法测定细胞上清IL-4和IFN-γ的分泌水平。结果:1.通过鉴定体外成功诱导培养出DC。尿酸浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml时能增强DC细胞表面CD83、CD86、IA/IE分子表达率;提高IL-12p70分泌水平(与阴性对照组相比,P<0.05);尿酸能增强DC刺激T细胞增殖能力(与阴性对照组相比,P值均小于0.05);尿酸浓度为70μg/ml时,细胞表面分子表达、IL-12p70分泌水平、刺激T细胞增殖作用与阴性对照组比较均无明显差别(P>0.05)。UA促进DC成熟的能力呈尿酸剂量依赖性增强。2. RTPCR结果示尿酸组与培养基对照组相比,TLRs mRNA表达出现明显的变化。TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA表达下降(P<0.05),以TLR4 mRNA下降最明显;IL-12p70表达显著增高(P<0.05);与LPS组相比,TLRs mRNA与IL-12p70 mRNA表达水平相似,无统计学差异,P>0.05。3.(1)免疫印迹示,尿酸刺激后,15min时,p- p38、p-ERK1/2、p-JNK、NF-κB表达量明显增加,30min时达到最大值,45min时则开始下降,与DMSO对照组相比,P值均小于0.05。使用相应抑制剂后,相关蛋白表达表不能测出。LPS组上述分子在45min时仍大量表达。(2)与未用相应抑制剂相比,使用SB203580、SP600125、PDTC等抑制剂预处理后,CD83、CD86、IA/IE表达及IL-12p70分泌水平均出现下降(P<0.05或0.01),其中,以SB203580的作用最明显;使用PD98059后,CD83、CD86、IA/IE表达及IL-12p70分泌水平则出现上升(P<0.05)。4. (1)免疫后一周或两周,HBsAg特异性CTL,以负载HBsAg的DC联合尿酸(400μg、200μg、100μg)接种组杀伤效应最强,400μg尿酸联合组一周时为32.45%±11.63%,两周时为74.56%±12.38%;与DC对照组相比,均具有显著性差异,P<0.05。DC对照组杀伤效应,一周时为14.33%±2.04%,两周时为28.18%±2.38%,与其它对照组相比,均具有显著性差异,P<0.05;单独尿酸免疫组、unpulsed-DC组的HBsAg特异性CTL杀伤效应与PBS对照组无显著性差异,P>0.05。HBsAg负载的DC免疫各组与HBS28-39负载各组,特异性CTL杀伤效应,无明显差异,P>0.05。荷肽或抗原DC免疫产生的特异性CTL杀伤效应呈尿酸剂量依赖性升高,与尿酸的接种次数亦有关。(2)免疫后两周,脾脏T细胞增殖反应,以负载HBsAg-DC联合尿酸(400μg、200μg、100μg)接种组最强,P-I值为1.764±0.114;与DC对照组相比,均具有显著性差异,P<0.05。DC对照组脾脏T细胞增殖反应,PI值为1.342±0.093,与其它对照组相比,均具有显著性差异,P<0.05;单独尿酸免疫组、unpulsed-DC组,脾脏T细胞增殖反应与正常对照组无显著性差异,P>0.05。HBsAg负载的DC免疫各组与HBS28-39负载DC免疫各组,脾脏T细胞增殖反应,无明显差异,P>0.05。荷肽或抗原DC免疫后脾脏T细胞增殖反应呈尿酸剂量依赖性升高。(3)免疫后两周,负载HBsAg的DC联合尿酸(400μg、200μg、100μg)接种组IFN-γ水平最高,IL-4水平最低,与DC对照组相比,均具有显著性差异,P<0.05;400μg尿酸联合HBsAg-DC免疫组IFN-γ、IL-4水平分别为552.361±24.034 pg/ml, 14.265±1.333 pg/ml。DC对照组脾脏细胞IFN-γ水平和IL-4水平,高于其它对照组,分别为266.575±51.324 pg/ml,22.385±2.252 pg/m(lP<0.05);单独尿酸免疫组、unpulsed-DC组,脾脏细胞IFN-γ水平和IL-4水平与正常对照组相比无明显变化(P>0.05)。HBsAg负载的DC免疫各组和HBS28-39负载各组,IFN-γ和IL-4水平,无明显差异,P>0.05。荷肽或抗原DC免疫后脾脏细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平呈尿酸剂量依赖性。结论:1.对体外培养诱导扩增的DC,尿酸可促进其成熟,提高表面共刺激分子表达;能增强其刺激T细胞增殖能力和分泌IL-12p 70的水平。UA的这些活性呈剂量依赖性。2.尿酸能调节未成熟树突细胞TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA等受体mRNA及IL-12 p70 mRNA表达。此可能为其诱导DC成熟及免疫功能提高的机理之一。3.未成熟树突状细胞p38、ERK1/2、PI3K、NF-κB等信号分子可由尿酸刺激磷酸化,相应信号分子抑制剂可抑制尿酸这种刺激作用。阻断相应上述信号分子通路,可对尿酸诱导的树突状细胞活性产生影响。阻断p38、JNK、NF-κB等信号通路能抑制尿酸对树突状细胞CD83、CD86、IA/IE等分子表达及IL-12p 70分泌的上调作用;阻断ERK1/2信号通路能增强尿酸对树突状细胞CD83、CD86、IA/IE等分子表达及IL-12p 70分泌的上调作用。尿酸可以调节P38、ERK1/2、JNK、NF-κB等信号分子的活化,从而促进DC表面分子表达及IL-12p 70分泌。此可能为尿酸能诱导DC成熟及免疫功能提高的机理之一。4.联合尿酸免疫接种,可增强负载HBsAg或S28-39的树突状细胞疫苗接种所诱导抗HBV的T细胞免疫应答,包括HBsAg特异性CTL、IFN-γ细胞因子的分泌、对T淋巴细胞的增殖能力。这些免疫效应的增强呈尿酸剂量依赖性。