前列腺癌(PCa)是西方国家男性中最常见的肿瘤之一,占癌症死亡率的第二位。随着人类平均寿命的延长和诊断技术的提高,前列腺癌的发病率和检出率在不断上升。我国前列腺癌的发病率虽然低于西方发达国家,但其增长也呈明显的上升趋势。前列腺穿刺活检是前列腺癌诊断的金标准,但是血清PSA>4ng/ml时穿刺阳性率只有1/3。近年来发现的人血管舒缓素激肽释放酶2和前列腺干细胞抗原也被证实为前列腺癌特异性基因,但它们并不能提高前列腺癌的特异诊断方法。所以,寻找新的前列腺癌诊断标志物,建立更加特异的诊断方法,是目前对前列腺癌诊断研究的热点。DD3基因是近年来所发现的一种前列腺癌特异基因。DD3 mRNA既能高表达于癌性前列腺上皮细胞株中(>95%),而且在前列腺癌发生时表达量明显升高,其诊断敏感性和特异性大于90%,目前被认为是一个具有临床应用潜力的前列腺癌标志物。进一步探明DD3基因在前列腺癌诊断、治疗、预后评估等方面应用将具有重要意义。本研究首先克隆了DD3基因片段,即根据外显子4设计一对引物,自LNCaP细胞中提取总RNA,以LNCaP细胞cDNA作模板,进行PCR扩增,将PCR扩增产物经凝胶电泳纯化后与PMD18-T载体连接,再将重组质粒转化感受态细胞进行克隆;提取重组质粒在紫外分光光度计上定量,作为定量检测的标准品。结果经重组质粒PCR扩增及序列测定,表明PMD18-T-DD3 cDNA克隆成功,可作为前列腺癌荧光定量RT-PCR检测方法的标准品并可应用于定量标准曲线的绘制,为前列腺癌DD3特异性基因荧光定量PCR方法的建立提供保证。本研究在完成DD3 mRNA重组质粒标准品建立的基础上,建立了实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性DD3 mRNA方法。经方法学验证结果证实,其最低检测限为1.64×101拷贝/ml,线性范围为1.64×101～1.64×1011拷贝/ml,证明具有良好的敏感性;经对扩增产物纯化后,直接测序分析并进行Blast同源性比较,证实有较好的特异性;同时经检测具有良好的稳定性和重复性。我们针对27例前列腺癌组进行DD3 mRNA检测发现其阳性例数显著高于非前列腺癌组和健康对照组,其中全血标本阳性例数为18(18)、尿液标本阳性例数为4(5)、前列腺液标本阳性例数为4(4);而在30份非前列腺癌患者标本中只有1份前列腺液出现低拷贝值1.984 log拷贝数/ml,其原因有待进一步观察确定;30份健康人标本均为阴性。对前列腺癌进行病理分级后并观测与DD3 cDNA拷贝数的变化,结果DD3 cDNA拷贝数随病理分级的增加而增高。对全血DD3 mRNA检测与血清PSA的检测进行检测,结果在18例前列腺癌全血标本中发现DD3 mRNA阳性例数为18,而PSA阳性例数为16;在20例非前列腺癌全血标本和10例健康全血对照标本中DD3 mRNA均为阴性;PSA在非前列腺癌组出现4例阳性,经对4例PSA阳性患者的临床病理结果调查,均不是前列腺癌。结果证明全血DD3 mRNA检测在特异性上优于PSA。在测定PSA mRNA定量的基础上,我们引入DD3得分概念,即将DD3 mRNA绝对值与PSA mRNA绝对值相除,发现其结果与我们先前的单独DD3 mRNA定量一致。本研究证实DD3基因是一种适用于前列腺癌诊断的特异性指标,可用于生物体液如血液、尿液和前列腺按摩液中少量癌细胞的检测,在前列腺癌的微转移诊断、预后判断、指导治疗等方面具有潜在的应用价值。