论文部分内容阅读
本文以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道微生物为研究对象,运用不同的微生物基因组提取方法提取了凡纳滨对虾肠道微生物的宏基因组DNA,并用分子生物学方法评价提取的基因组DNA质量,将所提质量最佳的凡纳滨对虾肠道微生物宏基因组DNA用于Solexa测序,进行相关生物信息学分析。结合传统微生物的培养方法和现代分子生物学的方法对凡纳滨对虾肠道微生物的可培养性进行了研究。本研究旨在通过不同物理形态的2216E基培养培养凡纳滨对虾肠道微生物,再利用细菌16S rDNA基因的限制性酶切多态性的方法分析所培养的微生物的多态性,从而来考察培养基的物理形态对于微生物生长的影响。主要内容分以下2部分:1.比较了CTAB-酚/氯仿法和微生物基因组提取试剂盒二种方法提取新鲜凡纳滨对虾肠道微生物宏基因组DNA的效果,结果表明CTAB-酚/氯仿法提取总DNA的得率(92.5ng/ L)是微生物基因组提取试剂盒(24.8ng/ L)的3.7倍,半定量PCR法检测二种方法微生物基因组相对含量分别为72.3%,67.6%。RNAdungeon是一种在提取细胞RNA前保存细胞样品的试剂,但其在保存微生物基因组方面的效果还未见报道。在本文中我们考察了RNAdungeon保存2周后对样品肠道微生物宏基因组质量的影响,结果表明RNAdungeon保存后提取总DNA浓度为36.7ng/ L,明显低于新鲜组织(92.5ng/ L)。CTAB-酚/氯仿法提取新鲜样品用于Solexa测序,结果显示宏基因数据中64.1%的数据属于未知序列,35.5%属于真核生物,而已知微生物和病毒序列所占比例仅有0.4%。2.通过传统培养海洋微生物的2216E培养基的液体、固体、半固体培养基培养凡纳滨对虾肠道微生物。培养72h后,分别富集培养的微生物并提取基因组,以提取的基因组为模板扩增16S rDNA ,于T载体连接后构建16S文库。用限制性内切酶Hin6ⅠRsaⅠBsuRⅠ对阳性克隆的PCR产物进行酶切分析,统计酶切带型。结果表明,未经培养组酶切带型有28种,液体培养的有14种,固体培养的有8种,半固体的有6种。三种条件共有的有2种酶切带型。而且有6种(23%)酶切带型在培养组没有分布。这表明,培养基的物理形态对微生物的生长具有一定的影响。且从酶切带型来看,凡纳滨对虾肠道微生物中的优势菌群不能被2216E培养基培养。