甜蛋白(Thaumatin)存在于西非热带雨林中一种竹芋科多年生草本(Thaumatococcus daniellii Benth)的果实胶质假种皮中。Thaumatin蛋白有甜味,而且它还具有低热量、安全无毒、甜味纯正及可被降解为体内所需氨基酸等优点,是一类高甜度而又不含糖的新型甜味剂,所以它被认为有希望发展成为食品工业中营养性碳水化合物的替代品而成为未来新型的甜味剂。但是T. daniellii在原产地之外不能正常结实,并且引种不成功难以大量生产,致使甜味蛋白成为十分昂贵的商品。生物技术的迅速发展启发人们用基因重组的手段开发甜蛋白,对这些甜味蛋白和矫味蛋白进行了克隆和测序,并将其表达于其他宿主。已经实现了甜蛋白在微生物中的表达,个别的还在一些植物中得到表达。因此,本试验在吸取前人经验的基础上,构建了植物表达载体pBI121- Thaumatin,并将其转入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌的介导将Thaumatin基因导入雪莲果中,并对转基因植株进行了检测,借以初步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况,为进一步转化园艺植物打下了基础。实验结果如下:(1)甜蛋白Thaumatin基因的人工合成和克隆本实验根据已报道的Thaumatin基因序列,采用重叠延伸PCR法人工合成Thaumatin全长基因,与T载体pMD19-T连接后转化DH5α,通过菌落PCR、双酶切、测序鉴定,得到克隆载体pMD-Thaumatin。(2)甜蛋白Thaumatin基因植物表达质粒pBI121- Thaumatin的构建与鉴定。利用DNA重组技术,将植物甜蛋白Thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,通过PCR、酶切、电泳鉴定Thaumatin基因已成功构建到植物表达质粒pBI121中。(3)pBI121- Thaumatin质粒转化根癌农杆菌重组质粒pBI121- Thaumatin通过直接转化法导入农杆菌EHA105中,利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)平板筛选阳性克隆,有单菌落生长,经过菌液PCR鉴定,证明重组质粒已转进农杆菌EHA105中。(4)植株再生体系的建立采用无菌苗雪莲果(Smallanthus sonchifolius)叶片为外植体,以MS为基本培养基,筛选出MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L形成愈伤组织, MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L以诱导不定芽的分化,并于1/2MS+NAA0.2mg/L生根培养,获得完整再生植株。(5)转化体筛选及植株再生将预培养3-4天的外植体与农杆菌菌液浸染5-15分钟后,共培养2-3天,然后转化到含MLPN和Kan的选择培养基上进行分化筛选,转入外源基因的转化体将会在这一系列筛选过程中发芽、生根,获得转基因植株。(6)转基因植株PCR检测提取转基因植株基因组DNA后,PCR扩增Thaumatin基因,证明thaumatin基因已导入雪莲果中,转化率为36.4%。