研究背景:糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是一种高发的慢性疾病,其主要特征为患者高血糖,因DM患者长期血糖过高,导致身体各种组织慢性损伤,而目前尚未出现根治DM的有效方法。在临床上针对DM的治疗也只是以血糖控制为主,但目前我国许多DM患者的血糖控制欠佳,因此DM患者出现多种并发症,其中糖尿病神经病理痛（Diabetic neuropathic pain,DNP）和抑郁症（Depression,DP）是DM患者的常见并发症。二者的合并症给DM患者带来了更加严重的身心影响,并且更加难以治疗。因此,迫切需要更有效的治疗方法。P2X7受体是嘌呤能受体家族成员之一,在神经系统的星形胶质细胞和小胶质细胞中广泛分步,二氢杨梅素（Dihydromyricetin,DHM）具有抗炎,抗氧化等多种药理作用,我们先前的研究已经表明在大鼠动物模型中DHM可通过降低DNP合并DP大鼠胶质细胞的激活及其P2X7受体的表达,从而缓解大鼠DNP和DP行为。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是神经营养家族的重要成员,其与抑郁和疼痛的发病机理密切相关,因此我们推测BDNF在DNP合并DP中也起重要作用。因此,本研究进一步观察了DHM对DNP合并DP大鼠中BDNF水平的影响及其作用机制研究,并在细胞水平上进一步观察了DHM对P2X7受体的影响及其作用机制研究,为临床上治疗DNP合并DP进一步提供实验依据。第一部分研究目的:本研究通过建立DNP和DP合并大鼠模型,观察DHM对合并大鼠海马（Hippocampus）、脊髓（Spinal cord,SPI）和背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）中BDNF和原肌球蛋白受体激酶（Tropomyosin receptor kinase B,Trk B）的影响及其作用机制,为临床上治疗二者的合并症提供新的方法。研究方法:将雄性SD大鼠随机分为4组:（1）对照组（Control）、（2）正常+二氢杨梅素组（Control+DHM）、（3）模型组（DNP+DP）、（4）模型+二氢杨梅素组（DNP+DP+DHM）。模型建立成功后,通过热缩足反射潜伏期（Thermal withdrawl latency,TWL）,机械缩足反射阈值（Mechanical withdrawal threshold,MWT）,强迫游泳试验（Forced swimming test,FST）,糖水偏好试验（Thermal withdrawl latency,SPT）和矿场实验（Open-field test,OFT）来监测模型大鼠行为学变化。采用蛋白印迹（Western blot,WB）和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）方法来检测各组大鼠海马,脊髓和DRG中BDNF、Trk B、IL-1β和TNF-α的表达水平。通过免疫荧光方法来检测大鼠海马,脊髓和DRG中BDNF和Trk B受体与神经元标志物Neu N的共表达情况。研究结果:1、大鼠模型建立成功后,模型组大鼠较正常组相比,其行为学测试TWL、MWT、SPT和OFT明显降低,FST不动时间明显升高（p<0.01）,在给予DHM治疗后,DHM治疗组较模型组TWL、MWT、SPT和OFT明显升高,FST不动时间明显降低（p<0.01）。2、q PCR和蛋白印迹结果表明,在DRG和脊髓组织中,模型组的BDNF和Trk B的m RNA和蛋白表达水平高于对照组,而海马中的BDNF和Trk B的m RNA和蛋白表达水平低于对照组（p<0.01）。DHM治疗可以显著逆转这些变化（p<0.01）。在海马,DRG和脊髓组织中,模型组的IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白表达水平高于对照组。但是,DHM治疗组的IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白的表达低于模型组（p<0.01）。3、免疫荧光结果表明,BDNF和Trk B与Neu N免疫荧光双标显示,BDNF-Neu N和Trk B-Neu N在海马,DRG和脊髓组织中都存在共表达。模型组的脊髓和DRG中的BDNF-Neu N和Trk B-Neu N的共表达高于对照组,而DHM治疗可降低这种升高（p<0.01）。在海马中,模型组的BDNF-Neu N和Trk B-Neu N的共表达低于对照组,而DHM治疗则逆转这种降低（p<0.01）。结论:DHM可通过调节神经系统中BDNF的表达水平来减轻大鼠糖尿病神经病理性疼痛和抑郁行为,其机制可能涉及抑制炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的释放。DHM有望成为临床上治疗DNP合并DP的有效药物。第二部分研究目的:本研究目的是观察二氢杨梅素（DHM）对高葡萄糖（High glucose,HG）,P物质（Substance P,SP）和皮质酮（Corticosterone,CORT）共培养的原代海马星形胶质细胞是否具有保护作用及其可能机制。研究方法:采用原代培养方法,取SD乳鼠海马星形胶质细胞原代培养,我们将纯化的原代星形胶质细胞随机分成8组:对照组（Control）,正常+二氢杨梅素组（Control+DHM）,正常+溶剂组（Control+Solvent）,正常+转染试剂组（Control+Transfection reagent groups）,高糖+P物质+皮质酮组（HG+SP+CORT）,高糖+P物质+皮质酮+二氢杨梅素组（HG+SP+CORT+DHM）,高糖+P物质+皮质酮+P2X7 sh RNA（HG+SP+CORT+P2X7 sh RNA）和高糖+P物质+皮质酮+sh RNA空载组（HG+SP+CORT+scramble sh RNA）。通过CCK-8和ELISA,检测细胞活性,筛选药物刺激浓度。细胞模型建立成功后,我们通过q PCR和蛋白印迹检测原代海马星形胶质细胞中P2X7受体的m RNA和蛋白表达情况。采用免疫荧光双标法检测细胞中P2X7受体表达情况。采用q PCR、蛋白印迹和ELISA法来检测原代海马星形胶质细胞中的IL-1β和TNF-α的表达水平。采用蛋白印迹法检测各组细胞中ERK1/2磷酸化情况。使用Fluo-3 AM试剂盒来检测各组原代海马星形胶质细胞中Ca2+信号的释放情况。通过流式细胞技术来观察各组原代培养星形胶质细胞的凋亡情况。研究结果:1.纯度鉴定结果:用GFAP和DAPI标记培养的原代细胞,免疫荧光结果表明,原代培养的海马星形胶质细胞的纯度>95%。2.建模浓度筛选:根据文献研究及预实验确定HG浓度为30 m M,SP药物浓度为5n M,CORT的药物浓度为0.1 m M,共培养时间为24h,及DHM的最佳使用浓度1μM较为适宜。3.P2X7测定结果:q PCR和蛋白印迹结果表明HG+SP+CORT组中P2X7的m RNA和蛋白表达水平高于对照组（p<0.01）。用DHM和P2X7 sh RNA处理后,HG+SP+CORT+DHM和HG+SP+CORT+P2X7 sh RNA组中P2X7的m RNA和蛋白表达水平显著低于模型组（p<0.01）。免疫荧光结果表明,HG+SP+CORT和HG+SP+CORT+scramble sh RNA组中的P2X7和GFAP表达水平高于对照组（p<0.01）。DHM和P2X7sh RNA处理后,HG+SP+CORT+DHM和HG+SP+CORT+P2X7 sh RNA组中的P2X7和GFAP共表达水平显著降低（p<0.01）。4.IL-1β和TNF-α测定结果:q PCR和蛋白印迹结果表明HG+SP+CORT组中IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白表达水平高于对照组（p<0.01）。DHM和P2X7 sh RNA处理后,HG+SP+CORT+DHM和HG+SP+CORT+P2X7sh RNA组中IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白质表达水平显著降低（p<0.01）。ELISA结果显示HG+SP+CORT组的IL-1β和TNF-α表达水平高于对照组（p<0.01）。DHM和P2X7 sh RNA处理组的IL-1β和TNF-α表达水平显著低于HG+SP+CORT和HG+SP+CORT+sh RNA空载组（p<0.01）。5.ERK 1/2磷酸化结果:蛋白印迹结果表明,HG+SP+CORT组中p-ERK1/2与ERK 1/2的IOD比值高于对照组（p<0.01）,HG+SP+CORT+DHM和HG+SP+CORT+P2X7 sh RNA组中p-ERK 1/2与ERK 1/2的IOD比明显低于HG+SP+CORT组（p<0.01）。6.Ca2+信号检测结果:HG+SP+CORT组的Ca2+信号释放与正常组相比有所增加,在DHM和P2X7 sh RNA处理后,Ca2+信号被下调至正常水平（p<0.01）。7.细胞凋亡结果:与正常组相比,我们观察到HG+SP+CORT组的凋亡明显增加（p<0.01）。DHM和P2X7sh RNA处理后的细胞凋亡恢复到正常水平（p<0.01）。8.全细胞膜片钳实验结果:表达P2X7受体的HEK293细胞被100μMATP激活,DHM（100μM）显著抑制了ATP激活电流。结论:DHM可以保护HG+SP+CORT共培养的原代海马星形胶质细胞免受P2X7受体介导的损伤。P2X7受体可能成为防治DNP合并DP的新靶点。DHM有望成为治疗糖尿病神经病理性疼痛合并抑郁症的潜在有效药物。HG+SP+CORT共同培养细胞可能是探索糖尿病神经病理性疼痛合并抑郁症细胞损伤的可行性细胞模型。