[背景]膀胱癌是泌尿系统常见的肿瘤之一,其中75%的原发病例为浅表性膀胱癌(TIS、Ta或T1期),25%的原发病例为浸润性膀胱癌(T2-T4期)。浅表性膀胱癌的治疗主要包括腔内电切手术治疗和术后膀胱灌注化疗预防肿瘤复发。对浸润性膀胱癌的患者,多采取根治性膀胱全切除术联合术后辅助化疗为主。尽管运用了多种多样的治疗手段,但仍有50%-70%的浅表性肿瘤患者复发和许多浸润性肿瘤转移的问题。浸润性肿瘤患者的5年生存率仅有14-30%。而且化疗中的耐药问题也限制了临床医生对膀胱癌的治疗,膀胱癌的治疗疗效难以令人满意。故寻找一种新的靶向基因治疗并研究其能否逆转膀胱癌的化疗耐药问题十分重要。肿瘤的发生发展是一个多因素影响的过程,与基因结构的改变及表观遗传学的改变均密切相关,表观遗传学是一种可遗传和可逆的基因修饰,指不改变DNA的序列,而通过改变基因的表型达到控制基因表达的修饰方式。表观遗传学修饰包括组蛋白修饰、染色质重塑、DNA甲基化修饰。DNA甲基化与肿瘤的形成、发展和耐药性的产生密切相关。DNA的甲基化是指DNA在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)催化下,把S-腺苷蛋氨酸(SAM)提供的甲基基团加在基因组中胞嘧啶的第5位碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。DNA甲基化通常发生在位于基因的5’端启动子区CpG岛。抑癌基因启动子的高甲基化可导致基因的转录失活而表达下调,造成肿瘤细胞的生长优势是肿瘤发生发展的重要机制之一。近来也有研究表明,启动子的高甲基化与肿瘤术后化疗的耐药性产生密切相关。DNA的甲基化需要甲基转移酶的催化作用,哺乳动物中有活性的甲基转移酶家族主要包括两类：一是DNA甲基转移酶1(DNMT1),在半保留复制中维持DNA的甲基化；二是DNA甲基转移酶3a (DNMT3a)和DNA甲基转移酶3b (DNMT3b),起着从头甲基化的作用,从头甲基化过程中DNMT3b占有主导地位。DNMT3b作为一种重要的甲基转移酶,已经被证实在多种肿瘤中表达增高且与肿瘤的发生发展和耐药性的产生密切相关。与基因突变不同,高甲基化修饰可使基因的转录失活,这种表观遗传学上的改变是可逆的。因此人们提出了通过敲低DNMT3b基因的表达,降低肿瘤中抑癌基因的甲基化程度来达到治疗肿瘤和逆转肿瘤耐药性的目的。在乳腺癌、肝癌细胞中,已经证实了通过敲低DNMT3b的表达,可以达到抑制肿瘤生长和逆转肿瘤细胞的耐药性的目的,但在膀胱癌中未见类似报道。因此,为了探讨DNMT3b表达与膀胱癌细胞的生长和耐药性问题的关系：本研究第一部分探讨DNMT3b低表达对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响,并检测生长和凋亡相关基因的表达及启动子区域的甲基化情况,研究DNMT3b基因在膀胱癌细胞增殖、凋亡过程中的作用并探讨其机制。本研究的第二部分探讨DNMT3b低表达对肿瘤化疗药物敏感性的影响,并检测耐药相关基因的表达及启动子区域的甲基化情况,研究DNMT3b基因对膀胱癌细胞化疗药物敏感性的影响并探讨其机制。通过体内外的实验,以期为膀胱癌的靶向治疗提供新的靶占——-DNMT3b,改善膀胱癌的预后。[目的]1.探讨DNMT3b低表达对膀胱癌细胞T24、5637和BIU-87增殖、凋亡的影响；并观察DNMT3b低表达对生长和凋亡相关基因RASSF1A、APK、Bax和Bcl-2的表达及启动子甲基化的调控作用。从分子生物学水平阐述DNMT3b沉默导致膀胱癌细胞株生物学行为变化的分子生物学机制。2.探讨DNMT3b低表达对野生型膀胱癌细胞BIU-87及阿霉素耐药细胞(BIU-87/ADM)阿霉素敏感性的影响；并观察DNMT3b低表达对耐药相关基因RASSF1A和hMLH1的表达及启动子甲基化的调控作用。从分子生物学水平探讨DNMT3b沉默与膀胱癌细胞化疗药物敏感性改变的相关性及可能的分子生物学机制。[方法]1低表达DNA甲基转移酶3b (DNMT3b)基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响的体内外研究1.1细胞培养及siRNA转染常规培养膀胱癌细胞株T24、5637和BIU-87并设计合成靶向DNMT3b基因的siRNA (siRNA-DNMT3b)和阴性对照siRNA (siRNA-NC),分别向各细胞株转入siRNA-DNMT3b和siRNA-NC。实验分为6组：T24-siRNA组,T24-NC组;5637-siRNA组,5637-NC组；BIU-87-siRNA组,BIU-87-NC组。1.2荧光定量PCR荧光定量PCR技术检测转染后T24、5637和BIU-87细胞株中DNMT3b mRNA的表达,荧光定量PCR技术检测转染后BIU-87细胞株中RASSF1A、 DAPK、Bax和Bcl-2 mRNA的表达。1.3 Western blotWestern blot技术检测转染后T24、5637和BIU-87细胞株中DNMT3b蛋白的表达；Western blot技术检测转染后BIU-87细胞株中RASSF1A、DAPK、Bax和Bcl-2蛋白的表达。1.4甲基化特异性PCR检测甲基化特异性PCR (MSP)技术检测转染后BIU-87细胞株中RASSF1A、 DAPK, Bax和Bcl-2启动子甲基化情况。1.5 MTT测定细胞增殖分别在转染0、24、48、72 h采用噻唑蓝法(MTT)测定细胞的增殖情况,在490nm波长的酶联仪上读取T24、5637和BIU-87细胞株中细胞的吸光度A值。1.6流式细胞仪检测细胞凋亡应用Annexin V+PI双染色技术,流式细胞仪检测转染后T24、5637和BIU-87细胞株中细胞凋亡情况。1.7慢病毒包装及稳定细胞株筛选利用基因合成的方法合成慢病毒穿梭质粒LV3-shRNA-DNMT3b和LV-shRNA-NC。LV3-shRNA-DNMT3b和LV-shRNA-NC分别转染BIU-87细胞。转染48h后,通过荧光显微镜检查绿色荧光蛋白的表达,测定转染效率。Puromycin筛选压力下培养稳定表达shRNA-DNMT3b的BIU-87细胞(BIU-87-shRNA)及其对照细胞(BIU-87-shNC).1.8裸鼠成瘤实验将BIU-87-shRNA及BIU-87-shNC膀胱癌稳定细胞株种植于裸鼠皮下。待肿瘤肉眼可见后,3-4天测量一次肿瘤体积。28天后饲养结束,处死裸鼠,取出皮下肿瘤,拍照。2低表达DNA甲基转移酶3b (DNMT3b)基因对膀胱癌细胞阿霉素耐药性影响的体内外研究2.1细胞培养及siRNA转染常规培养膀胱癌野生型细胞株BIU-87和耐药株BIU-87/ADM,分别向各细胞株转入siRNA-DNMT3b和siRNA-NC。实验分为4组：BIU-87-siRNA组,BIU-87-NC组;BIU-87/ADM-siRNA组,BIU-87/ADM-NC组。2.2荧光定量PCR荧光定量PCR技术检测转染后BIU-87和BIU-87/ADM细胞株中DNMT3b、 RASSF1A和hMLH1 mRNA的表达。2.3 Western blotWestern blot技术检测转染后BIU-87和BIU-87/ADM细胞株中DNMT3b、 RASSF1A和hMLH1蛋白的表达。2.4甲基化特异性PCR检测甲基化特异性PCR (MSP)技术检测转染后BIU-87和BIU-87/ADM细胞株中RASSF1A和1MLH1启动子甲基化情况。2.5阿霉素药物敏感性实验转染后的BIU-87、BIU-87/ADM细胞分别用不同浓度阿霉素处理72h后,使用MTT法测定细胞的增殖情况,计算野生型及耐药型膀胱癌细胞转染后阿霉素的半数抑制浓度(IC50)。2.6流式细胞仪检测阿霉素诱导的细胞凋亡转染后的BIU-87、BIU-87/ADM细胞分别用不同浓度阿霉素处理24h后,应用Annexin V+PI双染色技术,流式细胞仪检测野生型及耐药型膀胱癌细胞的凋亡情况。2.7慢病毒包装及稳定细胞株筛选稳定低表达DNMT3b的BIU-87细胞(BIU-87-shRNA)及对照细胞(BIU-87-shNC)为本实验第一部分构建并保存。同样方法构建稳定低表达DNMT3b的BIU-87/ADM细胞(BIU-87/ADM-shRNA)及对照细胞(BIU-87/ADM-shNC) 。2.8裸鼠成瘤实验将BIU-87-shNC、BIU-87-shRNA、 BIU-87/ADM-shNC和BIU-87/ADM-shRNA4株稳定细胞株种植于裸鼠皮下,每3天按照5mg/kg腹腔注射阿霉素,待肿瘤肉眼可见后,3-4天测量一次肿瘤体积。,28天后饲养结束,处死裸鼠,取出皮下肿瘤,拍照。3数据分析所有计量资料均采用均数±标准差表示,采用SPSS18.0统计软件进行分析,样本均数的比较采用Student’s t检验和One-way ANOVA,双侧P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1低表达DNA甲基转移酶3b (DNMT3b)基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡影响的体内外研究1.1 siRNA-DNMT3b转染下调T24、5637和BIU-87细胞DNMT3b mRNA和蛋白的表达荧光定量PCR和western blot检测结果显示,与NC转染组相比,siRNA-DNMT3b转染可以显著的下调T24、5637和BIU-87细胞DNMT3b的mRNA和蛋白水平(P<0.01)。说明,siRNA-DNMT3b可以有效干扰DNMT3b的表达,转染的细胞可以用于后续实验。1.2DNMT3b低表达抑制T24、5637和BIU-87细胞的生长MTT检测结果显示：与NC转染组相比,培养24 h后,siRNA干扰DNMTBb的表达对T24、5637和BIU-87细胞生长的没有影响,但培养48 h和72 h后,siRNA干扰DNMT3b的表达明显降低了T24、5637和BIU-87细胞生长。说明,DNMT3b低表达可以抑制T24、5637和BIU-87细胞的生长。1.3 DNMT3b低表达促进T24、5637和BIU-87细胞的凋亡流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示：T24-siRNA和T24-NC组细胞的凋亡细胞比例分别为：28.5%±2.3%和12.6%+1.9%(P<0.01);5637-siRNA和5637-NC组细胞的凋亡细胞比例分别为：24..6%±1.9%和12.3±1.8%(P<0.01)；BIU-87-siRNA和BIU-87-NC组细胞的凋亡细胞比例分别为：32.0%±2.2%和12.7%±2.0%(P<0.01)。说明,DNMT3b低表达可以促进T24、5637和BIU-87细胞的凋亡。1.4 DNMT3b低表达对BIU-87细胞生长及凋亡相关基因表达的影响荧光定量PCR和western blot检测结果显示：与NC组相比,DNMT3b低表达可以增加BIU-87细胞生长和凋亡相关基因DAPK, Bax和RASSF1A mRNA和蛋白的表达,抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表达。说明,DNMT3b低表达可能导致DAPK, Bax和RASSF1A的表达上调及Bcl-2的表达下调。1.5 DNMT3b表达对BIU-87细胞生长及凋亡相关基因甲基化的影响甲基化特异性PCR结果显示,与NC组相比较,DNMT3b低表达可以减少BIU-87细胞生长和凋亡相关基因DAPK, Bax, Bcl-2和RASSF1A启动子区域的甲基化水平。上述结果说明,DNMT3b低表达上调膀胱癌细胞中DAPK, Bax和RASSF1A的表达与其甲基化水平降低有关,但Bcl-2的表达下调的机制有待进一步探讨。1.6 DNMT3b低表达稳定细胞株的构建及DNMT3b稳定低表达对裸鼠瘤体生长的影响结果显示,BIU-87-shNC及BIU-87-shRNA中均成功表达绿色荧光蛋白(GFP)。荧光定量PCR和western blot的方法检测细胞中DNMT3b的表达水平显示LV3-shRNA-DNMT3b可以显著降低DNMT3b的mRNA和蛋白水平(P<0.01)。裸鼠皮下成瘤模型结果显示：注射细胞后7-19天,瘤体生长缓慢,BIU-87-shRNA和BIU-87-shNC组所成瘤体体积没有统计学差异；注射细胞20天和25天后的测量结果显示,BIU-87-shRNA组的瘤体的平均体积明显比BIU-87-shNC组小(P<0.01)。饲养结束,将瘤体取下并进行拍照,BIU-87-shRNA组的瘤体的体积明显比BIU-87-shNC组小。说明,DNMT3b稳定低表达可以对裸鼠瘤体生长具有明显的抑制作用。2低表达DNA甲基转移酶3b (DNMT3b)基因对膀胱癌细胞阿霉素耐药性影响的体内外研究2.1 siRNA-DNMBb转染下调BIU-87和BIU-87/ADM细胞DNMT3b mRNA和蛋白的表达荧光定量PCR和western blot检测结果显示,与NC转染组相比,siRNA-DNMT3b转染可以显著的降低BIU-87和BIU-87/ADM细胞DNMT3b的mRNA和蛋白水平(P<0.01)。说明,siRNA-DNMT3b可以有效干扰DNMT3b的表达,转染的细胞可以用于后续实验。2.2 DNMT3b低表达对膀胱癌细胞阿霉素耐药性的影响使用0,0.0125,0.025,0.05,0.1和0.2 mg/L的阿霉素处理BIU-87-NC和BIU-87-siRNA细胞,处理72 h后进行MTT检测,结果显示：经0.025,0.05和0.1 mg/L的阿霉素处理后,BIU-87-siRNA组的存活率与BIU-87-NC组相比有明显的降低(P<0.05)；但经最小浓度0.0125mg/L和最大浓度.0.2 mg/L的阿霉素处理后,BIU-87-siRNA转染组的存活率与BIU-87-NC组相比没有明显的变化(P>0.05)。使用0,0.5,1,2,4和8 mg/L的阿霉素处理BIU-87/ADM-NC和BIU-87/ADM-siRNA细胞,处理72 h后进行MTT检测,结果显示：经1,2,4和8 mg/L的阿霉素处理后,BIU-87/ADM-siRNA组的存活率与BIU-87/ADM-NC组相比有明显的降低(P<0.05)；但经最小浓度0.5mg/L的阿霉素处理后,BIU-87/ADM-siRNA组的存活率与BIU-87/ADM-NC组相比没有明显的变化(P>0.05)。根据阿霉素处理后的存活计算各组细胞的IC50o BIU-87-NC组的IC50为0.18 mg/L, BIU-87-siRNA组的IC50为0.14 mg/L,说明低表达DNMT3b对于野生型BIU-87细胞的IC50没有明显影响。 BIU-87/ADM-NC组的IC50为13.96mg/L,BIU-87/ADM-siRNA组的IC50为7.10 mg/L,说明低表达DNMT3b可以明显降低BIU-87/ADM细胞的IC50。说明,低表达DNMT3b可以逆转BIU-87/ADM的耐药性。2.3 DNMT3b低表达对阿霉素诱导的膀胱癌细胞凋亡的影响添加0.05 mg/L的阿霉素处理BIU-87-NC和BIU-87-siRNA细胞,添加2mg/L的阿霉素处理BIU-87/ADM-NC和BIU-87/ADM-siRNA细胞,处理24 h后流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示：阿霉素诱导的BIU-87-NC和BIU-87-siRNA细胞的凋亡比例分别为14.54±2.12%和27.84±1.57%(P<0.01)。阿霉素诱导的BIU-87/ADM-NC和BIU-87/ADM-siRNA细胞的凋亡比例分别为12.76±1.39%和25.68±2.20%(P<0.01)。说明,低表达DNMT3b可以促进BIU-87和BIU-87/ADM细胞阿霉素诱导的细胞凋亡。2.4 DNMT3b低表达对耐药相关基因表达的影响荧光定量PCR和western blot检测结果显示,BIU-87-NC组和BIU-87/ADM-NC组RASSF1A mRNA和蛋白的表达无明显差异,siRNA-DNMT3b转染可以显著的增加BIU-87和BIU-87/ADM细胞RASSF1A mRNA和蛋白的表达,结果说明了RASSF1A表达增加可能参与了抑制BIU-87和BIU-87/ADM细胞增殖,促进细胞凋亡,与细胞增殖及凋亡实验结果相符；而BIU-87/ADM-NC组hMLHl的表达较BIU-87-NC组明显较低,siRNA-DNMT3b转染可以显著的增加BIU-87/ADM细胞中hMLH1的表达,但对BIU-87细胞中hMLH的表达无明显影响,说明了hMLH1的低表达可能与BIU-87/ADM细胞阿霉素的耐药性产生有关,转染siRNA-DNMT3b后hMLH1的表达明显上升,这表明hMLHl的表达增高可能参与逆转BIU-87/ADM细胞阿霉素的耐药性,结果与阿霉素敏感性实验相符。上述结果说明了低表达DNMT3b逆转BIU-87/ADM细胞阿霉素耐药性的作用可能与hMLH1表达上调有关。2.5 DNMT3b低表达对耐药相关基因甲基化的影响采用甲基化特异性PCR检测DNMT3b低表达对耐药相关基因甲基化的影响。结果显示,与NC组相比较,DNMT3b低表达可以减少BIU-87和BIU-87/ADM细胞RASSF1A启动子区域的甲基化水平。DNMT3b低表达可以减少BIU-87/ADM细胞]hMLH1启动子区域的甲基化水平,但对BIU-87细胞hMLH1启动子区域的甲基化水平无明显影响。上述结果说明,DNMT3b低表达上调BIU-87、BIU-87/ADM细胞中RASSF1A和BIU-87/ADM细胞中hMLHl的表达与其启动子区域的甲基化水平降低有关。2.6 DNMT3b低表达稳定细胞株的构建及DNMT3b稳定低表达对阿霉素处理的裸鼠瘤体生长的影响结果显示,BIU-87-shNC、BIU-87-shRNA、BIU-87/ADM-shNC及BIU-87/ADM-shRNA中均成功表达绿色荧光蛋白(GFP)。荧光定量PCR和western blot的方法检测细胞中DNMT3b的表达水平显示LV3-shRNA-DNMT3b可以显著降低BIU-87、BIU-87/ADM细胞DNMT3b的mRNA和蛋白水平(P<0.01)。裸鼠注射各稳定细胞株后,每3天按照5mg/kg腹腔注射阿霉素,并对成瘤情况进行观察。裸鼠皮下成瘤模型结果显示：注射细胞后7-13天,瘤体生长缓慢,BIU-87-shRNA和BIU-87/ADM-shRNA组与对应阴性对照组细胞所成瘤体体积没有统计学差异；注射细胞后16-25天的测量结果显示,BIU-87-shRNA和BIU-87/ADM-shRNA组比对应阴性对照组平均体积小,差异有统计学意义(P<0.05)。饲养结束,将瘤体取下并进行拍照,BIU-87-shRNA和BIU-87/ADM-shRNA组的瘤体的体积明显比对应阴性对照组小。这些结果表明,DNMT3b稳定低表达对阿霉素处理的裸鼠瘤体生长具有明显的抑制作用。[结论]1 DNMT3b低表达可能通过上调DAPK, Bax和RASSF1A基因,下调Bcl-2基因的表达,从而抑制T24、5637和BIU-87膀胱癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡。2 DNMT3b低表达可能通过上调hMLHl基因的表达逆转耐药型膀胱癌细胞BIU-87/ADM的阿霉素耐药性。