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肝纤维化是由于长期受到损伤因子刺激后,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积,导致结缔组织异常增生的过程。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是ECM的主要来源。正常情况下,HSC作为储存维生素A的细胞在窦周间隙保持静止,但在损伤情况下,HSC转化为肌成纤维细胞,释放细胞因子,促进ECM的生成,这一过程称之为表型转化。c AMP直接激活的交换蛋白分子（exchange protein activated by c AMP,Epac）参与体内许多重要的信号通路,从而介导生物学效应。Epac1被激活时,Rap1（Ras-related protein-1）从无活性的Rap1-GDP置换为有活性的Rap1-GTP,进而激发下游信号通路发挥作用。然而,Epac1在HSC表型转化中的作用尚不清楚。白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP）是从芍药干燥根中提取的有效部位,其主要活性成分为芍药苷（paeoniflorin,Pae）。芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25）是对Pae进行酯化修饰合成的新的单体衍生物,能有效提高Pae的生物利用度。课题组前期研究表明,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中,CP-25具有良好的抗纤维化作用,100 mg/kg的CP-25与同剂量的TGP相比,抗纤维化能力更强。CP-25的抗纤维化作用是否与影响Epac1活性有关?为此,本课题收集肝纤维化患者肝组织标本,观察Epac1表达变化;使用CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,观察不同病程整体水平Epac1表达变化;同时,对CCl4诱导的肝纤维化小鼠灌胃给予CP-25,观察CP-25对Epac1的表达及纤维化的调节作用。体外实验选用人肝星状细胞株LX-2,选择性激动或抑制Epac1,观察其对LX-2细胞活化和下游相关通路的影响;以转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）刺激,建立体外纤维化模型,转染针对Epac1的小干扰RNA,检测细胞活化及下游相关信号通路的变化;另给予不同浓度的CP-25,探讨其可能的作用机制。目的:收集肝纤维化患者肝脏样本,检测α-SMA和Epac1表达变化。CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,同时灌胃CP-25,观察Epac1表达变化。体外采用刺激剂和小干扰RNA选择性激动或抑制Epac1,并给予CP-25,观察对LX-2细胞活化及下游相关信号通路的影响。明确Epac1在HSC表型转化中的可能作用,部分阐明CP-25抗肝纤维化的作用机制。方法:选取肝纤维化患者肝组织石蜡切片,免疫荧光法检测α-SMA和Epac1表达变化。采用CCl4诱导C57BL/6J小鼠建立肝纤维化模型,Western blot法检测肝脏胞质、胞膜中Epac1蛋白表达变化,同时免疫荧光双染法检测小鼠肝脏中α-SMA和Epac1的共定位。另外将小鼠分为正常组、模型组、CP-25组（25、50、100 mg/kg）、TGP组（100 mg/kg）,Western blot及免疫组化检测肝组织中α-SMA、III型胶原、Epac1、p-AKT、p-ERK表达变化体外实验中,选择性激动或抑制Epac1后,采用CCK-8法、细胞划痕法观察对LX-2细胞增殖、迁移的影响;Western blot检测α-SMA、III型胶原、I型胶原表达及AKT、ERK通路激活情况,Pull-down检测Rap1-GTP水平。进一步检测转染Epac1 si RNA,对LX-2细胞中α-SMA、III型胶原蛋白、下游信号通路及Rap1-GTP水平的影响。体外给予CP-25,Western blot观察LX-2细胞中α-SMA、III型胶原及AKT、ERK通路激活情况,Pull-down检测Rap1-GTP水平变化。结果:1. 肝纤维化患者HSC中Epac1的表达情况免疫荧光双染实验结果表明,在肝纤维化患者肝脏中活化的HSC标志物α-SMA的表达明显多于肝内胆管结石患者,同时,在肝纤维化患者肝脏中Epac1的表达也明显高于肝内胆管结石患者。2. 肝纤维化小鼠肝脏中Epac1和?-SMA表达变化免疫荧光双染实验结果表明,CCl4造模8周后,小鼠肝脏α-SMA表达多于正常组小鼠,且肝脏中Epac1表达也增多。3. 不同病程肝纤维化小鼠肝脏中Epac1表达变化Western blot结果显示,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏组织中,从造模4周开始,胞质中Epac1蛋白的表达明显降低,而胞膜中Epac1的表达明显升高。4. 选择性激动或抑制Epac1对细胞活化及下游信号通路的影响CCK-8、划痕实验结果显示,与对照组相比,非选择性激动Epac（8-p CPT）或选择性抑制Epac2（ESI-05）均可明显促进LX-2细胞的增殖和迁移;与8-p CPT组比较,选择性抑制Epac1（CE3F4）可以明显抑制LX-2细胞的增殖和迁移。Western blot实验结果表明,与对照组相比,8-p CPT或ESI-05增加LX-2细胞中?-SMA、I、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达;与8-p CPT组比较,CE3F4可降低LX-2细胞中?-SMA、I、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达。Pull-down实验结果显示,8-p CPT或ESI-05增加LX-2细胞中Rap1-GTP的表达;与8-p CPT组比较,CE3F4可降低Rap1-GTP的表达。5. 转染Epac1 si RNA对LX-2细胞中纤维化指标及下游通路相关蛋白表达的影响Western blot实验结果提示,与对照组比较,TGF-?1刺激后LX-2中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达明显升高;与TGF-?1刺激组相比,干扰Epac1的表达可明显降低细胞中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的表达。Pull down实验结果显示,与对照组比较,TGF-?1明显增加LX-2细胞中Rap1-GTP的水平;与TGF-?1刺激组相比,干扰Epac1明显抑制细胞中Rap1-GTP水平。6. CP-25对诱导的肝纤维化小鼠的影响HE、Masson染色结果显示,与肝纤维化模型组相比,CP-25可以降低胶原沉积,减轻肝纤维化程度。Western blot结果表明,与肝纤维化模型组相比,CP-25可以降低?-SMA、III型胶原的表达。免疫组化和Western blot结果表明,CP-25可以降低Epac1的表达。7. CP-25对LX-2细胞纤维化指标及下游信号通路相关蛋白表达的影响Western blot结果表明,与TGF-?1刺激组相比,CP-25 10-7～10-5 mol/L可以抑制LX-2细胞中?-SMA、III型胶原、p-ERK、p-AKT的产生。Pull down结果显示,与TGF-?1刺激组比较,CP-25 10-5 mol/L明显抑制LX-2细胞中Rap1-GTP的水平。结论:1.肝纤维化患者及肝纤维化小鼠肝组织中HSC激活增多发生表型转化,且HSC中Epac1的表达增加。肝纤维化过程中,Epac1的细胞分布发生变化,提示Epac1可能与肝纤维化发生发展有关。2.选择性激动Epac1可以促进LX-2细胞的增殖和迁移,增加?-SMA、III型胶原、I型胶原的表达,升高Rap1-GTP的水平,增加p-ERK、p-AKT的表达。提示选择性激动Epac1可能通过促进Rap1的活化,进而激活ERK、AKT通路参与HSC表型转化。3.体外向LX-2细胞转染Epac1 si RNA可以降低?-SMA、III型胶原的表达,降低Rap1-GTP的水平,降低p-ERK、p-AKT的表达。提示低表达Epac1可能通过抑制HSC下游Rap1的活化,随后抑制ERK、AKT信号的激活,发挥抑制HSC活化和胶原合成的作用。4.CP-25灌胃给药可减轻肝纤维化程度,降低Epac1的表达。体外给予CP-25,可抑制LX-2细胞中?-SMA、III型胶原的生成、降低Rap1-GTP的水平及p-AKT、p-ERK的表达。提示CP-25可能通过降低Epac1及下游Rap1的活化,进而抑制AKT、ERK信号的激活来发挥抗肝纤维化作用。