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转录后基因沉默(Post transcriptional gene silencing, PTGS)是植物抵抗病毒侵染的一种机制,病毒为了成功侵染寄主植物会编码RNA沉默抑制子。中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)伴随的卫星分子Beta (Tomato yellow leaf curl China Betasatellite, TYLCCNB)编码的唯一蛋白pCl是一个重要的致病因子和RNA沉默抑制子。βC1可以上调本氏烟中的钙调素类似蛋白基因Nbrgs-CaM来抑制RNA沉默途径中的重要基因NbRDR6的表达,从而抑制RNA沉默。Nbrgs-CaM被证实是一个植物内源的RNA沉默抑制子,并在βCl抑制次级小型干扰RNAs (Small interfering RNAs, siRNAs)的产生及诱导双生病毒的致病性中起了重要作用。植物病毒利用Nbrgs-CaM来反击寄主的防御反应,但是Nbrgs-CaM抑制RNA沉默的具体作用尚不清楚。本文围绕着Nbrgs-CaM与本氏烟沉默抑制子(Suppressor of Gene Silencing 3, NbSGS3)的互作开展深入的研究。NbSGS3在细胞内呈颗粒状分布,这种颗粒状结构被称为SGS3/RDR6小体(SGS3/RDR6 bodies)。对NbSGS3序列进行分析,发现它具有三个典型的结构域。为了明确它的哪一个结构域对于这种颗粒状的定位是必需的,我们分别构建了NbSGS3的各个结构域缺失突变体的亚细胞定位表达载体(pCHF3-NbSGS3-dZF-GFP, pCHF3-NbSGS3-dXS-GFP, pCHF3-NbSGS3-d2CC-GFP)。通过浸润H2B-RFP本氏烟,观察它们的亚细胞定位模式,我们发现NbSGS3的ZF和2CC结构域对于它的亚细胞定位很重要。为了探究NbSGS3的关键定位结构域是否也是它与Nbrgs-CaM的互作结构域,我们构建了NbSGS3的各个结构域缺失突变体的BiFC表达载体(2YN/2YC-NbSGS3-dZF, 2YN/2YC-NbSGS3-dXS,2YN/2YC-NbSGS3-d2CC)。通过在H2B-RFP本氏烟上共表达这些突变体蛋白,分析它们与Nbrgs-CaM蛋白在细胞内的互作情况,结果显示NbSGS3的ZF和2CC结构域对于它与Nbrgs-CaM的互作也是必需的。对Nbrgs-CaM的序列进行分析,发现它具有四个功能结构域。为了探究Nbrgs-CaM的哪个结构域决定了它与NbSGS3的互作,我们构建了Nbrgs-CaM的各个结构域缺失突变体的BiFC表达载体(2YN/2YC-NbCaM-dX,2YN/2YC-NbCaM-dEFI,2YN/2YC-NbCaM-dEFII,2YN/2YC-NbCaM-dEFIV)。在H2B-RFP本氏烟上研究Nbrgs-CaM不同结构域的缺失突变体与NbSGS3蛋白的互作情况,结果显示Nbrgs-CaM的EFI和EFII两个结构域对于它与NbSGS3的互作是必需的。为了明确Nbrgs-CaM与NbSGS3的互作结构域EFI和EFII对于Nbrgs-CaM的PTGS抑制子活性是否同样重要,我们将Nbrgs-CaM及其各个结构域缺失突变体构建到pCambia2300-Flag的重组表达载体上(pCambia2300-NbCaM-dX-Flag, pCambia2300-NbCaM-dEFI-Flag, pCambia2300-NbCaM-dEFII-Flag,pCambia2300-NbCaM-dEFIV-Flag)。分别在野生型本氏烟和16c本氏烟上进行RNA沉默抑制子鉴定实验,结果均显示Nbrgs-CaM与NbSGS3互作所必需的EFI和EFII两个结构域对于Nbrgs-CaM的沉默抑制子功能也是必需的。我们还发现Nbrgs-CaM的过量表达能够降低NbSGS3蛋白的积累量。这些结果说明Nbrgs-CaM可以与NbSGS3互作并降解NbSGS3蛋白的表达从而抑制RNA沉默。