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通过体细胞核移植技术,卵母细胞的重编程因子可将高度分化的体细胞重编程,形成重构克隆胚胎,并能发育成完整的动物个体。卵母细胞的质量和重编程能力是体细胞克隆技术最关键的限制因素之一。在体内正常发育过程中卵母细胞处于低氧环境,且卵泡液含有自由基清除剂和抗氧化酶,可保护卵母细胞免受氧化损伤。与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟（IVM）卵母细胞处于一个相对高氧的环境,并且缺乏自由基清除剂和抗氧化酶的保护,因而其活性氧水平较高,从而表现出较低的质量和发育潜力。活性氧的过量产生会引起氧化应激,破坏细胞膜并诱导细胞凋亡。褪黑素作为有效的自由基清除剂和广谱抗氧化剂,可直接清除活性氧并减少细胞氧化损伤。最近的研究表明,褪黑素存在于卵泡液中,同时在体外培养过程中补充褪黑素可提高卵母细胞的受精能力和发育能力,在早期胚胎发育期间补充褪黑素可显著改善SCNT胚胎的发育能力。然而,关于褪黑素如何改善卵母细胞质量和发育潜力的潜在机制需要进一步研究。另外,IVM期间添加褪黑素对后续胚胎发育的影响仍不清楚。因此,在这项研究中,我们通过在IVM培养基中补充褪黑素,探究其对体外牛卵母细胞质量和后续胚胎发育能力的影响机制。以下是主要试验内容:1.分别使用常规体外成熟培养液和添加了不同浓度褪黑素的体外成熟培养液培养GV期卵母细胞,发现添加10-9 M或10-7 M褪黑素可有效提高卵母细胞成熟率;将所得MII卵母细胞分别进行IVF和SCNT,发现10-9 M褪黑素添加组与10-7 M褪黑素添加组卵母细胞后续卵裂和囊胚发育率有显著提高;2.10-99 M褪黑素添加组与对照组卵母细胞进行系列试验:通过活性氧与早期凋亡检测试验发现褪黑素可有效清除活性氧,降低卵母细胞早期凋亡水平;通过α-tubulin抗体结合试验发现褪黑素有效改善纺锤体形态畸形和染色体排列紊乱;通过使用线粒体荧光探针发现褪黑素使线粒体活性提高并均匀分布;通过免疫荧光染色发现褪黑素提高了卵母细胞全基因组H3K9ac水平,降低其H3K9me3水平,并对DNA 5mC和5hmC水平有微弱影响;3.10-9 M褪黑素添加组与对照组卵母细胞分别进行IVF和SCNT,将所得囊胚进行CDX2差异染色试验和TUNEL凋亡检测试验,统计发现,10-99 M褪黑素添加组卵母细胞发育而来的囊胚质量总体高于对照组;同时免疫荧光染色试验发现褪黑素处理过的卵母细胞在SCNT中具有接近于IVF对照组的重编程潜力。4.使用RNA高通量测序进行褪黑素处理和未处理卵母细胞的全基因组表达分析,发现在处理组与对照组之间,有谷胱甘肽S-转移酶基因GSTP1、线粒体DNA聚合酶基因POLG、线粒体ATP合成酶基因ATP5F1E、中心粒富集基因CEP295、纺锤体装配相关基因TCTP、细胞保护和抗凋亡相关基因HSP27、以及参与蛋白质降解和DNA损伤修复的基因UBB等26个基因差异表达,显示这些基因很有可能在褪黑素影响卵母细胞发育的机制中起到关键作用。我们的研究结果表明,褪黑素可有效缓解卵母细胞氧化应激,显著降低其早期凋亡水平,保护其纺锤体与线粒体完整性,改善其表观修饰,从而提高卵母细胞质量和发育潜力,并显著促进后续克隆胚胎和体外受精胚胎的发育。