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目的:舍格伦综合征（Sjogren’s syndrome,SS）是一种以唾液腺进行性分泌功能下降和淋巴细胞浸润为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病,主要表现为口干、唾液腺及泪腺肿大,可累及或伴发全身多系统免疫性损害,严重影响患者的生活质量。T淋巴细胞大量浸润和功能异常是SS的重要病理机制,其中辅助性T细胞17（T helper 17,Th17）是一类具有促炎作用的T细胞亚群,在SS的发病和进展过程中起着重要作用。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因其具有自我更新、多向分化潜能及免疫调节特性为SS提供了新的治疗方向。MSCs来源的外泌体（exosomes derived from MSCs,MSC-Exo）是MSCs分泌的一种纳米级别的膜性囊泡,具有和MSCs相似的免疫调节能力,对SS具有一定的疗效。根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）分离提取于年轻恒牙根尖牙乳头,是神经嵴来源的成体干细胞群,体外扩增能力强,来源充足,获取无医源性创伤,尤其在调控T细胞分化中表现出独特的优势。SCAP来源的外泌体（exosomes derived from SCAP,SCAP-Exo）对SS的治疗效果和作用机制尚不清楚。MSC-Exo中的非编码RNA被认为是其发挥功能的主要物质,其中PIWI-interactingRNA（piRNA）是新发现的一类内源性非编码小RNA,可通过靶向结合mRNA的3’UTR区并诱导其降解,进而调控细胞表型与功能,在自身免疫性疾病的发病和T细胞的分化中均具有重要作用。本实验应用SS小鼠模型,通过尾静脉注射SCAP-Exo,观察其对SS小鼠唾液分泌、颌下腺淋巴细胞浸润水平以及外周血和脾脏内Th17细胞比例的影响;并通过体外实验探究SCAP-Exo及其piRNA对Th17分化的调控作用,为牙源性MSC-Exo应用于SS治疗提供理论基础。研究方法:1.分离提取SCAP,采用流式细胞术、成骨和成脂分化实验对其进行鉴定。采用超高速离心法提取SCAP-Exo,通过纳米颗粒跟踪技术和透射电镜对SCAP-Exo的形态及粒径进行分析;Western blot检测外泌体特异性标记蛋白Alix、CD9、CD63及细胞内质网特异性蛋白Calnexin的表达。2.以NOD/Ltj小鼠作为SS动物模型,检测唾液分泌水平并通过HE染色观察颌下腺淋巴细胞浸润程度,对SS小鼠进行鉴定;尾静脉注射SCAP-Exo,检测唾液分泌水平,ELISA检测血清中IL-17A表达水平,流式细胞术检测脾脏及外周血中Th17亚群比例,HE染色观察颌下腺淋巴细胞浸润程度,免疫荧光染色观察颌下腺Th17细胞浸润程度。3.免疫磁珠法分离外周血中CD4+T细胞,并构建CD4+T细胞向Th17分化的诱导体系,分别加入不同浓度的SCAP-Exo（20,40μg/m L）,流式细胞术检测Th17细胞比例,ELISA检测细胞上清液中IL-17A表达水平,qRT-PCR检测Th17相关基因IL-17A、IL-21、RORγt的mRNA表达水平。4.以骨髓间充质干细胞来源的外泌体（exosomes derived from bone marrow MSCs,BMMSC-Exo）为对照组,对SCAP-Exo和BMMSC-Exo中的piRNA进行高通量测序,统计、分析piRNA表达谱,并对SCAP-Exo中表达量前四十的piRNA进行靶基因预测和生物信息学分析,筛选与Th17分化相关的piRNA。通过数据分析,选取hsa-piR-15254为目标piRNA,IL-6R为其候选靶基因。5.PKH67荧光标记SCAP-Exo,观察SCAP-Exo被CD4+T细胞胞吞情况;SCAP-Exo处理CD4+T细胞,qRT-PCR检测hsa-piR-15254表达水平;双荧光素酶报告基因活性检测hsa-piR-15254与IL-6R mRNA的靶向结合性;构建hsa-piR-15254 mimics及hsa-piR-15254 inhibitor,并加入CD4+T细胞向Th17分化的诱导体系,流式细胞术检测Th17细胞比例,ELISA检测细胞上清液中IL-17A表达水平,qRT-PCR检测IL-6R、IL-17A、IL-21、RORγt的mRNA表达水平。6.应用SPSS 21.0统计软件,两两比较采用方差分析（LSD-t检验）,颌下腺病理评分分级采用秩和检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.SCAP阳性表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD90及CD105,不表达造血干细胞表面标记物CD31、CD34、CD45;成脂诱导4周后,可见细胞内脂滴形成;成骨诱导4周后可见矿化结节形成。超高速离心法能够成功从SCAP培养上清中提取SCAP-Exo,粒径大小为30-150 nm,透射电镜下可见SCAP-Exo呈椭圆形杯状囊泡样结构,Western blot显示SCAP-Exo阳性表达Alix、CD9和CD63,而不表达细胞内质网特异性蛋白Calnexin。2.NOD/Ltj小鼠具备SS的病理特征,HE染色可见颌下腺内呈现明显的淋巴细胞浸润灶,唾液分泌量显著低于健康小鼠（P<0.01）。尾静脉注射SCAP-Exo后,SS小鼠唾液分泌水平得到显著改善;HE染色发现颌下腺淋巴细胞浸润团明显减少、缩小,甚至消失;免疫荧光染色发现颌下腺中Th17细胞浸润减少,流式细胞术检测脾脏及外周血中Th17细胞比例下降;ELISA检测血清中IL-17A表达水平降低,且差异均具有统计学意义（P<0.01）。3.免疫磁珠法分离的外周血中CD4+T细胞纯度可达90%以上;20μg/m L、40μg/m L的SCAP-Exo均能抑制CD4+T细胞向Th17分化,细胞上清液中IL-17A浓度及Th17相关基因RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA表达水平显著下调;且40μg/m L的SCAP-Exo抑制效果更为明显（P<0.05）。4.高通量测序发现SCAP-Exo中piRNA表达丰富,共发现593种piRNA表达;表达量前四十的piRNA的靶基因与Th17细胞分化相关信号通路呈显著富集关系;其中,hsa-piR-15254在SCAP-Exo中高表达,并且可能靶向抑制Th17细胞分化通路的关键信号IL-6R。故选取hsa-piR-15254作为研究SCAP-Exo调控CD4+T细胞向Th17分化机制的目标piRNA。5.外泌体示踪实验发现荧光标记的SCAP-Exo能够被CD4+T细胞胞吞,并上调CD4+T细胞中hsa-piR-15254的表达;双荧光素酶报告基因检测证实hsa-piR-15254与Th17分化的关键信号IL-6R的mRNA存在靶向结合作用;SCAP-Exo中高表达的hsa-piR-15254可通过靶向结合IL-6R抑制CD4+T细胞向Th17分化,细胞上清液中IL-17A浓度（P<0.05）及Th17相关基因RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA表达水平下调（P<0.05）。结论:SCAP-Exo能够改善SS小鼠唾液分泌,减少颌下腺淋巴细胞浸润,降低颌下腺、脾脏以及外周血内Th17细胞亚群比例与血清中IL-17A表达水平;SCAP-Exo能够被CD4+T细胞胞吞并转运hsa-piR-15254,靶向调控IL-6R的表达,抑制CD4+T细胞向Th17分化及Th17相关基因和蛋白表达水平,进而发挥免疫调控作用。