目的:三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）约占乳腺癌患者的15-20%,具有疗效差、易发生远处转移等特点。由于TNBC特殊的分子表型,不能从内分泌治疗及抗HER2靶向治疗中获益,化疗仍是目前较为推荐的治疗方法。但化疗也存在复发率高、获得性耐药等问题,使得TNBC患者5年死亡率仍为70%。因此,迫切需要发掘更有效的治疗药物。目前新药研发仍存在周期长、耗资大、成功率低等问题,因此已有大量研究着眼于药物重定位的方法进行现有药物的再利用,利用这种方法已经成功地将一些老药用于新的适应症。药物研发还有一个重要的部分就是从天然产物中发现与优化先导化合物,大量最新研究集中在开发药理学安全的、具有生物活性的植物化学物质作为乳腺癌的预防和治疗药物。本研究基于药物重定位的方法发现了一种降压药米贝地尔可以在TNBC中发挥抗肿瘤作用,基于天然产物的研究发现了一种天然活性物质白藜芦醇可以调节TNBC肺转移的免疫微环境,并探讨了它们抗肿瘤作用的机制,为TNBC的治疗提供新的策略和理论基础。研究方法:1、利用TCGA、METABRIC和GEO数据库分析TNBC的特异性差异表达基因。2、利用CMap数据库进行药物预测。3、利用CCK-8实验检测细胞的增殖能力。4、利用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的情况。5、利用Pharm Mapper和Swiss Target Prediction数据库进行药物靶点预测。6、利用String数据库和Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络。7、利用Autodock软件进行分子对接分析。8、利用蛋白免疫印迹实验检测蛋白表达水平。9、利用转染si RNA或c DNA质粒技术,下调或上调目标蛋白的表达。10、利用异种移植模型研究米贝地尔在体内的作用。11、利用免疫组织化学染色技术检测肿瘤组织中蛋白的表达情况。12、利用苏木精-伊红染色技术检测米贝地尔对荷瘤鼠心脏、肝脏、肾脏的影响。13、利用TNBC肺转移实验性小鼠模型研究白藜芦醇对TNBC肺转移的影响。14、利用苏木精-伊红染色技术检测荷瘤鼠肺转移灶的情况。15、利用免疫组织化学染色技术检测荷瘤鼠肺组织中蛋白的表达情况。16、利用流式细胞术检测荷瘤鼠肺组织中免疫细胞的浸润。17、利用实时荧光定量PCR法检测m RNA的表达水平。18、利用ELISA法检测细胞因子蛋白的表达水平。19、利用流式细胞术检测目的细胞群的数量。结果:1、利用公共数据库筛选得到TNBC特异性表达基因。通过对TCGA、METABRIC和GSE76275三个数据集进行分析,共筛选得到167个上调和140个下调的TNBC特异性表达差异基因。2、利用CMap数据库预测得到米贝地尔可能是TNBC的潜在治疗药物。将TNBC特异性表达基因上传到CMap数据库进行药物预测,从预测结果中筛选出T型钙通道阻滞剂米贝地尔可能对TNBC具有潜在的抗肿瘤作用。3、米贝地尔抑制TNBC细胞的生长。CCK-8实验结果显示,米贝地尔可以抑制TNBC细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖。4、米贝地尔可以诱导TNBC细胞的凋亡。流式细胞术分析显示,米贝地尔以剂量依赖性方式诱导TNBC细胞的凋亡。5、米贝地尔可以诱导TNBC细胞周期阻滞。流式细胞术分析显示,米贝地尔以剂量依赖性方式诱导TNBC细胞周期阻滞于G1期。6、预测米贝地尔的作用靶点。利用Pharm Mapper和Swiss Target Prediction数据库预测得到米贝地尔的潜在人类作用靶点共185个。7、筛选出AURKA是米贝地尔在TNBC中的潜在作用靶点。通过构建蛋白质网络及分子对接等方法,筛选得到AURKA与米贝地尔结合的亲和力最强。8、米贝地尔抑制AURKA及其磷酸化蛋白的表达水平。WB实验结果显示,米贝地尔以剂量依赖性方式降低TNBC细胞中AURKA及其磷酸化蛋白的表达水平。9、米贝地尔调节TNBC细胞凋亡及细胞周期信号通路。用米贝地尔处理TNBC细胞可显著增加促凋亡蛋白裂解PARP的表达水平,降低抗凋亡蛋白BCL2的表达水平,同时也可显著下调细胞周期蛋白Cyclin D1及Cyclin B1的表达水平。10、米贝地尔通过AURKA调节TNBC细胞的凋亡。流式细胞术分析显示,敲减AURKA抑制了米贝地尔诱导的促凋亡作用,而过表达AURKA可显著增强米贝地尔诱导的细胞凋亡。11、米贝地尔通过AURKA调节凋亡相关蛋白表达水平。WB实验结果显示,敲减AURKA抑制了米贝地尔诱导的裂解PARP增多及BCL2降低的程度,而过表达AURKA显著增强了米贝地尔诱导的裂解PARP增多及BCL2降低的程度。12、米贝地尔在体内抑制三阴性乳腺癌生长。异种移植模型实验结果显示,与对照组相比,米贝地尔治疗组中肿瘤大小、重量和体积均显著降低。同时免疫组化结果显示,米贝地尔治疗组的小鼠肿瘤组织中Ki67表达下降,TUNEL表达增强,且AURKA及p-AURKA的表达下降。13、米贝地尔体内未出现明显的副作用。米贝地尔治疗组与对照组之间,小鼠体重没有显著的差异。HE染色结果显示,未观察到米贝地尔对荷瘤鼠心脏、肝脏和肾脏等重要器官产生明显的毒副作用。14、白藜芦醇抑制TNBC肺转移及肺内肿瘤生长。TNBC肺转移实验性小鼠模型研究显示,腹腔注射白藜芦醇可显著减少肺内转移灶的形成,并抑制肺转移灶中肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡。15、白藜芦醇促进T细胞向肺组织浸润。流式细胞术分析显示,腹腔注射白藜芦醇可显著提高荷瘤鼠肺组织内CD8+T细胞的百分比和数量,同时增加肺组织内CD4+T细胞的数量。16、白藜芦醇影响肺巨噬细胞的数量及向M1型极化。流式细胞术分析显示,腹腔注射白藜芦醇可显著提高荷瘤鼠肺组织内M1型巨噬细胞的百分比,降低M2型巨噬细胞的百分比,从而导致M1与M2型巨噬细胞的比值显著增加。17、白藜芦醇对髓系来源抑制细胞无明显影响。流式细胞术分析显示,腹腔注射白藜芦醇对荷瘤鼠肺组织内髓系来源抑制细胞的百分比和数量都无显著影响。18、白藜芦醇促进荷瘤鼠肺组织局部Th1型免疫应答。腹腔注射白藜芦醇可显著增加肺组织内Th1型细胞因子IL-2和IFN-γm RNA及蛋白的表达水平,同时降低肺组织内IL-6 m RNA及蛋白的表达水平。19、白藜芦醇增强了CD8+T细胞的抗肿瘤功能。实时荧光定量PCR实验结果显示,白藜芦醇可显著提高荷瘤鼠肺组织内CD8+T细胞IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B m RNA的表达水平。流式细胞术分析显示,白藜芦醇处理组荷瘤鼠肺组织内产生IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B的CD8+T细胞的数量也显著增加。20、白藜芦醇下调肺组织内CD8+T细胞PD-1的表达。实时荧光定量PCR实验结果显示,白藜芦醇下调了荷瘤鼠肺组织内CD8+T细胞PD-1 m RNA的表达。流式细胞术分析显示,白藜芦醇可以使荷瘤鼠肺组织内表达PD-1的CD8+T细胞的百分比和数量均显著下降。结论:1、米贝地尔可以抑制TNBC的生长,并通过抑制AURKA及其磷酸化蛋白的表达水平调节凋亡相关信号通路,发挥抗肿瘤作用。2、白藜芦醇可以抑制TNBC的肺转移,影响肺组织局部微环境中免疫细胞的浸润,提高Th1型免疫应答,并下调肺组织内CD8+T细胞PD-1的表达,增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。