背景血管的慢性炎症贯穿整个动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生发展过程。特别是在动脉粥样硬化早期阶段,内皮功能障碍发挥了主要的作用。在多种致病因素的作用下,血管内皮细胞活化,粘附分子、致炎细胞因子及化学趋化因子的表达增加,协助炎症细胞浸润,造成内皮功能障碍、氧化应激增加,细胞凋亡、脂质沉积,最终导致动脉硬化的发生。转录因子κB (NF-κB)活化与动脉粥样硬化的炎症反应发生和发展密切相关。NF-κB是由P50, P52, P65, Re1B和c-Rel等五种分子组成的同源或异源二聚体并参与调控体内病理生理如免疫、炎症、增殖等过程。在细胞处于正常状态时,NF-κB的组成成分限制在胞浆中,而当细胞受到外界刺激后,NF-κB抑制因子(IκBs)被其上游的IκB激酶(IKK)复合物激活,发生磷酸化,随后被泛素化及蛋白酶体降解,最终导致NF-κB(主要是P65/P50二聚体形式)的释放并由胞浆转位至胞核,参与调控目的基因的转录及表达。在动脉粥样硬化形成的过程中,氧化应激发挥着重大作用。氧化应激是过量的活性氧与内源性清除活性氧的抗氧化系统间失去平衡。活性氧影响血管内皮的很多功能,如介导血管内皮细胞和平滑肌细胞生长、凋亡和存活等表型调节,内皮依赖的血管扩张,参与血管壁缺失一氧化氮(NO)生物活性而损伤,增加单核细胞粘附和在血管生成中起作用。丹皮酚磺酸钠(Sodium Paeonolsilate, SPae)是从中药牡丹皮中分离提取的丹皮酚经磺化、成盐形成的一种新的化合物,具有抗炎、止痛、抗肿瘤、抗脂质过氧化、免疫调节等多重作用,近年有研究表明其具有抗动脉粥样硬化作用,但具体作用机制仍不清楚。因此,我们观察了丹皮酚磺酸钠对血管炎症影响,并探讨其可能的作用机制。目的1.研究丹皮酚磺酸钠对肿瘤坏死因子α (TNF-a)诱导的单核细胞粘附分子、致炎因子及化学趋化因子受体表达的影响。2.研究丹皮酚磺酸钠对TNF-α诱导内皮细胞的NF-κB活性、氧化应激的影响及可能的机制。方法1)人动脉内皮细胞1human aortic endothelial cells, HAECs)的培养人动脉内皮细胞(himan aortic endothelial cells, HAECs)培养在含有10%FBS的ECM培养基中,置于5%C02,37℃培养箱中培养,每三天换一次液,并根据需要进行传代和铺板。2)细胞模型的建立HAECs与5,10和20ng/ml的fNF-α共孵育24h, Western Blot检测内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达。3)单核细胞粘附实验用终浓度为5μmol/L的钙黄绿素-AM (calcein-AM)标记的THP-1细胞接种在HAECs上。避光条件下,37℃共同孵育2h。用PBS轻轻清洗细胞2-3次,去除未粘附的单核细胞,加入2mlPBS,于激光共聚焦显微镜下观察,激发波长485nm,发射波长530nm。4) ROS检测按照ROS试剂盒操作说明,运用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探针检测丹皮酚磺酸钠处理后,细胞内超氧化物的释放情况。5) NO、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)检测按照NO、SOD、LDH试剂盒操作测定一氧化氮、超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶。6) Western blot蛋白检测检测丹皮酚磺酸钠处理后,细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达,磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS),以及NF-κB.p-IKKβ活性。7)小鼠在体炎症模型的建立本实验采用30μg/kg TNF-α经腹腔注射(i.p.)48h建立小鼠在体炎症模型。8)血清中ICAM-1、VCAM-1、白介素8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)检测取动脉血,按照ELISA试剂盒说明,检测血浆中ICAM-1、VCAM-1、IL-8、MCP-1水平。免疫组化麻醉小鼠,取出胸主动脉,蔗糖梯度溶液中脱水,石蜡包埋组织,石蜡切片机切片,主动脉按冠状切面切取厚度为4μm的组织切片,-80℃保存。按照操作步骤进行ICAM-1和VCAM-1的组织染色。结果1.丹皮酚磺酸钠能够抑制TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达,减少活性氧簇(ROS)释放,增加NO、SOD的生成。2.丹皮酚磺酸钠上调TNF-α诱导的内皮细胞eNOS磷酸化水平和降低NF-κB活性及p-IKKβ的表达。3.丹皮酚磺酸钠在体模型上抑制TNF-α诱导的血管炎症反应。结论丹皮酚磺酸钠能够抑制TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达,减少活性氧簇(ROS)释放,增加NO、SOD的生成,降低血管炎症反应,维持内皮细胞正常功能。背景巨噬细胞泡沫化和炎症因子在动脉粥样硬化(AS)发生发展中扮演了重要角色。内皮功能障碍被是AS的始动因素,而脂质代谢紊乱是AS发生的关键环节。氧化应激一方面引起内皮损伤,另一方面修饰LDL成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。 ox-LDL-一方面加剧内皮炎症,另一方面加速巨噬细胞形成泡沫细胞。而泡沫细胞凋亡或坏死后,将细胞内的脂质释放出来,形成条纹状粥样硬化斑块。由此可见,泡沫细胞的形成在动脉粥样硬化的发生、发展中同样扮演着一个十分重要的角色。从中药牡丹皮中分离提取的丹皮酚经磺化、成盐形成的丹皮酚磺酸化钠(Spae),具有抗炎、止痛、抗肿瘤、抗脂质过氧化、免疫调节等多重作用,我们上一章节已经发现SPae具有抵抗肿瘤坏死因子α(TNF-a)诱导的氧化应激效应和抗血管炎症。同时,众多研究证明细胞泡沫化形成也伴随着炎症的产生和氧化应激的的继续,我们进一步观察SPae是否抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化和动脉粥样硬化形成。为此,本课题从以下三个方面在细胞模型和在体模型探讨SPae对ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化和动脉粥样硬化形成的影响。1.建立巨噬细胞泡沫化细胞模型,并观察SPae对巨噬细胞泡沫化吞噬ox-LDL能力的影响,以及对清道夫受体CD36、清道夫受体A (SRA)和ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)的表达的影响；2.采用apoE-/-小鼠动脉硬化模型,研究SPae对AS的治疗作用；3.从分子水平探讨其潜在的作用机制。目的：1)研究APse对巨噬细胞泡沫化形成的影响2)探讨载体模型中,SPae对AS早期斑块发展的影响。方法：1)巨噬细胞泡沫化模型建立与鉴定THP-1细胞经10Ong/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导分化24h后,80μg/mL ox-LDL处理分化后的细胞24h。用预冷PBS洗2次,60%异丙醇固定5min,0.3%油红O染色液染色15min,洗去染色液,倒置显微镜下观察,巨噬泡沫细胞内有大量红色脂肪滴的存在,表明THP-1巨噬细胞已经泡沫化。2)药物处理方法随机分为6组,分别为正常组、高剂量对照组、模型组、高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组。其中模型组为80μg/mL的ox-LDL处理THP-1巨噬细胞24h, SPae治疗组中SPae预孵育2h后,加入80μg/mL的ox-LDL共孵育24h,高、中、低剂量分别是40μM、20μM、10μM SPae。3)油红O染色按照方法2处理好的细胞,用60%异丙醇固定5min,0.3%油红O染色液染色15min,PBS洗2遍,水性封片剂封片。荧光显微镜下白光观察,随机拍照。4)细胞内胆固醇含量的测定及ROS、NO、SOD检测按照方法2处理好的细胞,根据细胞内胆固醇测定试剂盒说明书,检测细胞内总胆固醇、胆固醇酯的含量；及按照ROS、NO、SOD各试剂盒操作测定活性氧族、一氧化氮、超氧化物歧化酶。5)SPae对THP-1巨噬细胞与Dil-oxLDL结合的影响4-C下10μg/mL Dil-oxLDL与按照方法2处理好的细胞孵育2h,PBS洗3次,用激光共聚焦显微镜(400×)随机拍照,激发波波长520nm和发射波波长580nm。6)SPae对THP-1巨噬细胞与Dil-oxLDL摄取的影响4-C下10μg/mL Dil-oxLDL与按照方法2处理好的细胞孵育4h,PBS洗3次,用激光共聚焦显微镜(400×)随机拍照,激发波波长520nm和发射波波长580nm。7)SPae对THP-1巨噬细胞清道夫受体CD36与SR-A表达的影响按照方法2处理好的细胞,Western Blot分析SPae对THP-1巨噬细胞清道夫受体CD36与SR-A表达的影响。8)SPae对THP-1巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)的表达的影响按照方法2处理好的细胞,Western Blot分析SPae对THP-1巨噬细胞ABCA1表达的影响。9)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、 NF-κB、P38、JNK以及氧化应激的影响。Western Blot检测ox-LDL对THP-1巨噬细胞的NF-κB抑制因子α(IκBα)、IκB激酶β (IKKβ)、P38、pP38、PPARγ、JNK和P-JNK蛋白表达的影响。按照NO、SOD、LDH试剂盒操作测定一氧化氮、超氧化物歧化酶、活性氧。10)apoE-/-小鼠动脉硬化模型的建立选用15只雄性apoE基因敲除小鼠,3只野生型雄性C57BL/6J小鼠组,其中apoE基因敲除小鼠随机分成5组,分别是模型组、高剂量对照组、高剂量防治组、中剂量防治组、低剂量防治组,每组3只。实验开始时,所有动物同步给药,每天给药一次,并同时高脂喂食,连续给药喂食12周。11)免疫组化与免疫荧光麻醉小鼠,取出解剖分离心脏,主动脉,蔗糖梯度溶液中脱水,OCT包埋组织,冰冻切片机切片,主动脉按冠状切面切取厚度为81μm的组织切片,-80℃保存。油红O染色,倒置显微镜下观察主动脉窦部和主动脉红色的动脉粥样硬化斑块的情况；免疫组化的方法检测斑块内1mac-3、VCAM-1的水平；应用免疫荧光的方法,检测PECAM-1,评价主动脉根部血管内皮完整性。12)血清ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、MCP-1、IL-8和LDL-C水平水平小鼠麻醉后,自小鼠摘除眼球,分离血清,并分别检测血清ICAM-1、 VCAM-1、TNF-α、MCP-1和IL-8水平和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。结果：1)巨噬细胞泡沫化模型建立成功；2)SPae浓度依赖性抑制THP-1巨噬细胞泡沫化的形成；3)SPae一方面抑制THP-1巨噬细胞SRA和CD36的表达,降低THP-1巨噬细胞与Dil-ox-LDL的结合和摄取能力,另一方面提高ABCA1的表达,加强胞内游离胆固醇逆转运出细胞；4)小鼠在体模型显示,SPae抑制动脉硬化斑块蓄积,同时减轻在体炎症反应。结论：SPse可调控PPARγ和NF-κB活性和氧化应激反应,调控清道夫受体和ATP结合盒转运蛋白A1的表达,并调节动脉粥样硬化过程中炎症的产生,达到抗动脉粥样硬化的目的。背景与非糖尿病患者相比,糖尿病能显著增加心血管疾病的发病率和死亡率。迄今为止,冠脉支架已广泛地应用于临床急性冠心病事件；它可以明显地改善患者的临床预后,且具有较高的操作成功率和良好的早期临床效果。虽然传统的金属裸支架已深入应用于各种冠心病患者,并取得了一定的疗效；然而,其长期预后和再狭窄率一直困扰着临床医师。近些年来,西罗莫司洗脱支架被用来治疗裸金属支架术后再狭窄和初次冠脉狭窄,并取得长足的进步。一直来,国内外对冠心病合并糖尿病-------这群特殊患者的治疗探索从未停顿；但其在不同的临床试验中,西罗莫司洗脱支架和裸金属支架治疗该类患者的疗效和安全性,仍具相当的争议性。目的通过Meta分析方法,在较大样本量的前提下,评价西罗莫司洗脱支架与金属裸支架治疗冠心病合并糖尿病的西方人群和中国人群的临床疗效和安全性。方法制定了详细的纳入与排除标准后,同时根据拟定的上述标准制定出全面、系统的检索策略；要求所选择的文献设计类型为国内外的临床对照实验。中文检索关键词：雷帕霉素洗脱支架；西罗莫司洗脱支架；金属裸支架；糖尿病；冠心病。英文检索关键词：rapamycin eluting stent; sirolimus eluting stent; bare metal stents; diabetes; coronary arterial disease。按照改良Jadad评分标准,两位独立的研究人员对纳入研究的每篇文献做质量评价,遇到争议之处,通过协商解决；无法达成一致时,向第三位评价者询问,1-3分为低质量,4-7分为高质量。纳入文献的结果测量指标为二分类变量,采用优势比(Odds Ratio, OR)作为疗效分析的统计量,使用95%可信区间(confidence interval, CI)表示。统计结果以森林图表示。分别用漏斗图、Begger’s和Egger’s检验三种方法评估发表偏倚。结果最终纳入18篇符合标准的文献。包括西罗莫司洗脱支架组的1764例和金属裸支架组的1912例病例。西方人群的10篇文献得分在2-7之间,其中2篇低质量文献,8篇属于高质量文献；而中国人群的8篇文献得分在1-2之间,均属于低质量文献。在西方人群的研究,SEM组的靶病变血运重建率均显著的低于BMS组,合并效应量为0.26,95%可信区间为(0.16,0.45)；在中国人群的研究,SEM组的靶病变血运重建率均显著的低于BMS组,合并效应量为0.30,95%可信区间为(0.14,0.62)。在西方人群的研究,SEM组的心肌梗死发生率低于BMS组,合并效应量为0.94,95%可信区间为(0.66,1.35)；在中国人群的研究,SEM组的心肌梗死发生率低于BMS组,合并效应量为0.64,95%可信区间为(0.31,1.31)。西方人群的研究SEM组的平均死亡率高于BMS组,合并效应量为1.11,95%可信区间为(0.72,1.73),而中国人群的研究SEM组的平均死亡率低于BMS组,合并效应量为0.62,95%可信区间为(0.22,1.76)。西方人群的研究,SEM组的主要心血管不良事件发生率显著的低于BMS组,合并效应量为0.40,95%可信区间为(0.28,0.58)；中国人群的研究,SEM组的主要心血管不良事件发生率显著的低于BMS组,合并效应量为0.25,95%可信区间为(0.15,0.42)。西方人群的亚组分析显示SEM组的主要心血管不良事件发生率显著的低于BMS组,当样本量≤90,合并效应量为0.30,95%可信区间为(0.19～0.47)；随机对照试验的亚组分析,合并效应量为0.30,95%可信区间为(0.22～0.40)；欧洲人群的亚组分析,合并效应量为0.42,95%可信区间为(0.32～0.56)。结论1、在西方人群与中国人群的研究,SEM组的靶病变血运重建率均显著的低于BMS组。2、在西方人群与中国人群的研究,SEM组的心肌梗死发生率均低于BMS组,但差异均无统计学意义。3、西方人群的研究SEM组的平均死亡率高于BMS组,而中国人群的研究SEM组的平均死亡率低于BMS组,但差异均无统计学意义。4、在西方人群与中国人群的研究,SEM组的主要心血管不良事件发生率均显著的低于BMS组。SEM较BMS更加适合治疗伴有糖尿病的冠心病患者。