论文部分内容阅读
先天性心脏病(简称先心病)是胎儿期心脏及大血管发育异常所致的先天性畸形,发病率在活产婴儿中占6%0-10%0。我国每年约出生15万先心病患儿,造成社会家庭严重的精神经济负担。青紫型先心病是先心病中最严重的类型,畸形复杂,可致顽固性低氧血症,未经治疗,早期死亡率高达80%。圆锥动脉干畸形占青紫型先心的60%-70%。法洛四联症是圆锥动脉干畸形最常见的类型,约占所有先心病的12%,基本病理改变为右室流出道梗阻、室间隔缺损、主动脉骑跨及右心室肥厚。研究其发病机制有利于预防、产前诊断及早期干预,对于减轻社会家庭精神、经济负担有重要意义。目前普遍接受的观点为先心病是内在遗传易感因素和外界环境致畸因素共同作用的结果。先心病候选基因的研究是目前先心病发病机制研究的热点。圆锥动脉干畸形是遗传综合症DiGeroge综合症(DGS)的主要心脏表现,研究发现,80%-100%DGS患者伴染色体22q11.2的单倍体微缺失。目前该区域已分离出20-30个候选基因,HIRA基因位于该区域,作为DGS的候选基因之一,受到广泛关注。在动物实验中,下调鸡胚HIRA在神经嵴细胞中表达,90%鸡胚发生永存动脉干畸形；下调小鼠HIRA基因表达,小鼠心脏袢化失败。法洛氏四联症作为最常见的圆锥动脉干畸形,也是22q11.2微缺失的常见表型。据此推测,HIRA基因可能是TOF的候选基因。但是人类TOF与HIRA的相关研究非常有限。本课题组前期通过TOF患儿右室流出道心肌HIRA基因表达研究发现HIRA基因在TOF患儿表达较正常降低。其表达降低的原因有待于进一步探讨。本课题拟对法四患儿HIRA基因进行编码区序列分析,探讨HIRA蛋白结构变化与TOF发生的关系：同时分析HIRA基因3’UTR区序列,探寻可能与3’UTR区结合的micro RNAs,找出TOF患儿右室流出道心肌HIRA表达降低的原因。初步解释HIRA基因在TOF发病中的作用机制。第一部分HIRA基因编码区序列分析目的：对中国TOF患儿中HIRA基因编码区进行序列分析,探讨HIRA基因编码区变异与TOF的关系。方法：收集TOF患儿外周血278例及年龄和性别与病例组尽量匹配的健康儿童外周血500例,提取基因组DNA,对HIRA基因全部编码区进行测序,突变位点病例组扩大到500例,对氨基酸的改变进行生物信息学预测,将野生型HIRA基因mRNA与突变后mRNA注入斑马鱼单细胞时期后观察斑马鱼表型进行突变功能验证。结果：1.在12外显子发现1个已报导的SNP c.G1339GA (rs150603624),其发生频率与NCBI dbSNP数据库报导的频率无统计学差异。2.第17外显子发现1个突变c.C2301CA,频率为1/500,用生物信息学网站预测发现其氨基酸改变对其蛋白质功能影响不大,在物种间保守性不高,推测该突变可能为良性突变。3.第23外显子发现1个突变c.C3026CT,频率为2/500,生物信息学网站预测发现其氨基酸改变对其蛋白质功能影响大,突变位点在不同特种间高度保守,推测该突变可能为致病性突变,突变mRNA注射后斑马鱼的心脏畸形发生率明显高于野生型。小结：HIRA基因23外显子突变c.C3026CT可能为致病性突变,可能导致先心病的发生。第二部分HIRA基因3’UTR序列分析及相关micro RNAs研究目的：对中国TOF患儿HIRA基因3’UTR进行序列分析,探讨HIRA基因3’UTR序列变异对调控其micro RNAs的影响。方法：收集TOF患儿外周血278例及年龄和性别与病例组尽量匹配的健康儿童外周血500例,提取基因组DNA,对HIRA3’UTR进行测序,用生物信息学网站预测SNP位点周围的micro RNAs,用双荧光素酶报告基因检测系统及real-timePCR检测micro RNA与HIRA 3’UTR的相互作用。结果：1.HIRA基因3’UTR SNP(rs:117447448)位点的分布在病例组和对照组中存在统计学差异(P=0.001)。2.在线预测SNP(rs:117447448)位点上游8 bp存在microRNA 328的结合位点。3.共同转染p-silencer+miR328质粒和pgl3-promoter+HIRA3’UTR质粒293细胞荧光素酶的活性(0.0125±0.0006)低于单独转染pgl3-promoter+HIRA3’UTR质粒的活性(0.01963±0.0038),其差异有统计学意义(P=0.0327)。转染p-silencer+miR328质粒的293T细胞HIRA基因的表达(1.03961±0.0772)较转染p-silencer空载质粒的表达(1.60865±0.2749)降低,差异有统计学意义(P=-0.037)。4.用SNP(rs:117447448)位点不同基因型的质粒与miR328共同转染293细胞,不同基因型的荧光素酶活性无统计学差异(P=0.38)小结HIRA基因3’UTR区rs:117447448SNP位点可能与TOF的发生相关：HIRA基因是micro RNA328的靶基因。rs:117447448SNP位点不是micro RNA328作用于HIRA基因的主要靶位。