目的:双酚A（Bisphenol A,BPA）是一种高产量（high production volume,HPV）化学品,常用于食品包装材料、牙科密封剂、医疗器械和热载体。通过摄入、吸入和皮肤接触BPA是普遍存在的现象。美国的疾病控制和预防中心（Centers for Disease Control,CDC）的报告指出,大约超过90%的美国人口的尿液样本可能含有一定含量的BPA。BPA被证明能够通过与多种生理受体相互作用发挥影响,如雌激素受体α/β（estrogen receptorα/β,ERα/β）被证明能够与BPA产生结合、雌激素相关受体γ也被发现可以与BPA相互作用、雄激素受体（androgen receptor,AR）被指出能够与BPA结合和甲状腺激素受体也被发现与BPA能够相互作用,BPA可以与他们结合显示出内分泌干扰作用。许多研究调查指出了BPA的生殖毒性,并进行了广泛的审查,以解决有关BPA毒性的具体作用方式以及作用浓度。2006年,由国家环境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences,NIEHS）、国家牙科颅面研究所（National Institute of dental Craniofacial Research,NIDCR）、美国环境保护署（US Environmental Protection Agency,EPA）和公益组织组成的专家小组审查了人体在体内和体外暴露于BPA的情况[15]。专注于体内动物研究的专家小组发现,研究结果与调查结果出现相互矛盾的现象。然而,研究者仍然确信BPA会影响男性和女性的生殖系统。此外,最近的流行病学研究表明,BPA暴露可能与激素水平的改变、卵巢和子宫功能的损害以及精子质量的降低有关。实验研究的最新数据表明,在动物模型中,BPA暴露对卵母细胞质量和成熟产生不利影响,精子产量和质量下降,睾丸细胞受损,激素水平紊乱,卵巢功能和子宫形态中断。最近,环境、食品、消费品和人类尿液样本中BPA类似物的流行情况已有报道。由于与BPA在结构上高度相似,所以我们推断这些类似物也可能具有与BPA类似的内分泌干扰能力,这些类似物也并可能对生殖系统产生不利影响。新的证据表明BPA类似物与各种生理受体相互作用,如雌激素受体α和β、雄激素受体和芳香烃受体。在这里,我们本研究通过在孕期给予孕鼠不同浓度的BPA干预,建立BPA孕鼠模型,研究不同剂量BPA对子代大鼠学习记忆功能的影响,并探讨其可能作用机制。实验方法:1、实验动物与分组选取Wistar大鼠30只,大鼠选择10周龄左右的雌性成年大鼠,大鼠平均体重200～220g,所有的大鼠购买后在正式饲养前应该适应性的喂养1周。随后将大鼠按体重进行随机分为3组:0 mg/kg/天组、5 mg/kg/天组和50 mg/kg/天组,每组10只雌性大鼠。每组雌性大鼠与正常雄性大鼠按1:2交配,以妊娠0天（gestational day0,GD0）为第一天。从GD0开始,用管饲法将不同浓度的BPA溶解于乙醇（终溶液的1%）中,并用冲洗良好的自来水稀释至规定浓度)。0 mg/kg/天组接受含1%乙醇的水（溶媒）。通过胃给药,喂药持续到子代出生后的第21天（postnatal day 21,PND21）。在子代出生后的第4天（PND4）时,对于每窝仔鼠进行分选,为了保障让每只仔鼠能够从母鼠身上获得更好的营养,确保每只仔鼠能够维持正常的生长发育状态,每窝保留8～10只仔鼠,以保证尽可能相同的性比。2、孕鼠、子代大鼠及子代大鼠器官重量记录分别于孕早、孕中、孕晚期记录孕鼠体重。记录新生大鼠体重。在PND21天,称重并记录子代的小脑、左海马、右海马、脾脏、甲状腺和胰腺。3、海马长时程突触可塑性的测定大鼠用20%体积分数的乌拉坦进行静脉注射给药麻醉,将麻醉后的大鼠固定于大鼠立体定向仪上。参照Paxions的大鼠脑图谱,将双极刺激电极插入海马CA3区锥体细胞层。记录电极插入海马CA1区锥体细胞层。单次刺激诱发群体峰电位。在30分钟的基线记录后,给予相同参数的高频刺激5秒钟。观察刺激后海马CA3-CA1区突触可塑性的变化。采用单脉冲实验观察刺激引起的群体棘波幅度或场兴奋性突触后电位斜率的变化,并观察这种变化的持续时间。4、免疫荧光在PND7、PND14和PND21,通过心脏灌流的方式处死大鼠,取出大脑。将大脑组织固定于4%的多聚甲醛的固定剂,固定过夜。石蜡包埋,制作5微米冠状切片。进行试验时,首先通过梯度二甲苯和梯度酒精脱蜡至水后,利用微波的方式修复抗原,使用试剂盒中的封闭血清进行封闭,一抗在4℃下培养过夜。在37℃下重新加热30分钟,将PBS浸泡,然后与荧光抗体在无光下培养2小时。PBS洗脱第二抗体,滴入含DAPI的抗猝灭封片。在倒置荧光显微镜下观察并采集典型照片。5、TUNEL分析对于TUNEL,载玻片也脱蜡,再水化,在95°水浴中放入p H值为6的10m M柠檬酸盐中30分钟进行渗透,并在37°下用1μg/ml蛋白酶K进一步消化10分钟。接下来,根据制造商的说明,将罗氏原位细胞死亡检测试剂盒中的TUNEL试剂荧光素应用于载玻片。光学显微镜下观察。6、逆转录和定量实时PCR根据制造商的方案,用TRIzol分离不同因子处理24小时后的组织总RNA。使用RT反应试剂盒通过反转录总RNA合成互补DNA。定量实时PCR用于根据前面描述的程序,使用按需分析Taqman基因表达分析测定m RNAs水平。结果在至少五个独立实验中进行了三次。SYBR Premix Ex Taq用作DNA特异荧光染料。所有反应至少重复三次。软件计算目标蛋白表达含量与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）相关的基因表达水平。7、蛋白质印迹将匀浆液进行超声破碎,随后进行离心,通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。电泳分离,转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉密封1小时。一抗培养过夜。二抗室温下孵育1h,ECL化学发光反应。以GAPDH为内参照进行分析蛋白浓度。8、统计分析本研究中所有实验重复3次,3次独立实验研究的结果都通过平均值±标准差的形式表达,采用SPSS17.0软件对本研究中数据进行统计分析。P<0.05代表存在差异。实验结果:1、BPA对孕鼠和仔鼠生理功能的影响本研究分别对孕鼠施用5mg/kg/d BPA和50mg/kg/d BPA,并在不同时期测定孕鼠体重。结果表明,BPA对孕鼠体重无影响。为了确定BPA暴露是否会通过抑制器官发育而影响后代的生物学行为,我们称重并记录了后代的小脑、左海马、右海马、脾脏、甲状腺和胰腺的重量。结果表明,BPA对仔鼠体重无显著影响。结果表明,BPA对子代器官重量无显著影响。不同浓度BPA暴露前后,海马CA1区锥体细胞层出现典型的场电位变化。结果表明,低浓度BPA对雌性和雄性后代均无LTP发生。高浓度BPA暴露后,雄性仔鼠海马CA1区PS波幅和f-EPSP斜率的增加均低于对照组。提示高浓度BPA暴露可引起雄性后代LTP损伤。2、BPA对仔鼠海马神经元增殖的影响免疫荧光染色结果显示,高浓度BPA可抑制雄性仔鼠海马齿状回区神经元Nestin的表达。但雌性后代没有明显变化。Western-blot和real-time pcr结果显示,BPA在50mg/kg/d时,雄性仔鼠海马Nestin和cyclin d1的表达显著下调,而在5mg/kg/d时则不明显。实时荧光定量PCR结果也显示,与PND7相比,PND14和21的Nestin表达略有下调。此外,BPA对雌性仔鼠海马Nestin和cyclin d1的表达没有显著影响。3、BPA对子代大鼠海马神经元凋亡的影响Tunel分析结果显示,高浓度BPA可促进雄性仔鼠海马CA1区神经元凋亡,而对雌性仔鼠海马CA1区神经元凋亡影响不大。Western-blot和real-time pcr结果显示,BPA 50mg/kg/d时,雄性仔鼠海马bcl-2表达下调,bax表达上调,而BPA 5mg/kg/d时则不表达。对于雌性后代,BPA对海马bcl-2和bax的表达没有显著影响。4、BPA对子代大鼠海马神经元Rho A/Rac-1表达的影响由于Rho A和Rac-1在海马神经发育中起重要作用,我们研究了BPA对海马神经元Rho A和Rac-1的影响。荧光染色结果显示,50mg/kg/d BPA可显著上调雄性仔鼠海马CA1区Rho A的表达,下调Rac-1的表达。低浓度BPA对雌性后代的影响不显著。Western-blot和real-timepcr结果显示,BPA在50mg/kg/d作用下,雄性仔鼠海马Rho A表达上调,Rac-1表达下调,而在5mg/kg/d BPA作用下则不明显。westernblot和real-timepcr结果显示BPA对雌性仔鼠海马Rho A和Rac-1的表达无明显影响。结论:1、高浓度BPA暴露后,雄性仔鼠海马CA1区PS波幅和f-EPSP斜率的增加均低于对照组。2、孕期和哺乳期BPA暴露可通过影响海马神经元的生长和凋亡而损害雄性后代的海马的学习与记忆功能。3、高浓度BPA可抑制雄性仔鼠Nestin、cyclin d1、bcl-2和Rac-1的表达,促进bax和Rho A的表达。