自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorders, ASD)是常见的神经系统发育失调导致的广泛性发展障碍。一般于儿童期(3岁以前)发病,以社交障碍、沟通能力缺陷以及重复刻板动作为主要临床特征。流行病学研究报道ASD发病率约为6/1000到10/1000,且近年发病率有上升趋势。目前我国国内ASD发病率尚无大规模流行病学统计资料,但根据目前其他国家的发病率,保守估计中国目前至少有100万ASD患者。目前认为,ASD是环境因素与遗传易感性共同作用的结果。而宫内环境是最重要的环境因素之一,因此自闭症亦被称为“胎源性疾病”。研究发现胚胎发育早期,即受精后20至40天的器官形成期为自闭症发病的易感期。如果在此期间胚胎受药物、重金属或母体不良状况等宫内环境因素的影响,胚胎未来发生自闭症的风险显著升高。Ras/Raf/ERKl/2 (extracellular signal-regulated kinase)信号通路是丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)成员,对神经前体细胞的生成、神经脊的形成和发育、突触信号传递,以及意识、学习和记忆能力的形成有重要作用。此外,Ras/Raf/ERK1/2信号通路还参与介导神经细胞死亡。近年来,诸多研究证实Ras/Raf/ERKl/2信号通路异常是数种智力发育异常综合征发病的分子机制,但其与自闭症发病的关系尚不明确。我们前期研究发现,自闭症患者大脑额叶皮质和小脑组织中抗凋亡蛋白Bc12水平异常降低,而凋亡前蛋白p53水平异常升高,提示神经细胞异常死亡与自闭症发病相关。此外,最近研究报道16号染色体上ERK1编码基因缺失与自闭症发病相关。据此,我们推测Ras/Raf/ERK1/2信号通路在自闭症发病中起重要作用。为验证上述假说,本研究拟首先检测自闭症患者脑组织中Ras/Raf/ERK1/2信号通路的变化情况,了解该通路在自闭症患者脑组织中是否存在异常改变；同时利用自闭症动物模型进一步验证脑组织中Ras/Raf/ERK1/2信号通路各信号分子的表达水平和活性变化；最后,针对Ras/Raf/ERK1/2信号通路的异常变化,特异性对该通路进行调控,通过观察其对神经细胞各种行为的影响,初步探讨其应用于自闭症治疗的可能性,期待寻找针对自闭症发病分子机制的治疗方法。经过上述研究,初步了解Ras/Raf/ERK1/2信号通路在自闭症发病中的作用,为进一步的临床研究提供理论依据。第一章自闭症患儿大脑皮质及小脑Ras/Raf/ERKl/2通路信号异常上调[目的]Ras/Raf/ERK1/2信号通路是神经前体细胞生成、神经脊形成和发育以及突触信号传递的重要通路,对意识、学习和记忆能力的形成有重要作用。近年诸多研究证实Ras/Raf/ERK1/2信号通路异常是多种智力发育迟滞(mental retardation)发病的分子机制。为检测自闭症患儿脑组织中是否也存在Ras/Raf/ERK1/2通路信号异常,我们逐一检测了自闭症患儿脑组织标本中Ras/Raf/ERK1/2信号通路中各信号分子表达水平及活性变化,初步探求Ras/Raf/ERK1/2信号通路在自闭症发病中的作用和意义。[方法]1、脑组织标本来源自闭症患儿(平均年龄(8.3±3.8)岁)及正常对照儿童(平均年龄(8±3.7)岁)的新鲜冰冻脑组织标本购自NICHD发育障碍患者脑和组织库(NICHD Brain andTissue Bank for Developmental Disorders)。2、制备脑组织匀浆标本,Bradford法测定蛋白浓度冰冻额叶皮质及小脑组织标本置于冰匀浆缓冲液(50 mM pH 7.4 Tris-HCl,8.5%蔗糖,2 mM EDTA,10 mM 0巯基乙醇及蛋白酶抑制剂)中充分匀浆(10%w/v)。Bradford法测定标本蛋白浓度。3、Western blot比较各信号分子表达水平及活性变化脑组织匀浆标本加以等体积SDS上样缓冲液(20%甘油,100 mM pH 6.8 Tris,0.05%溴酚蓝(w/v),2.5% SDS (w/v),250mM DTT),100℃加热5分钟使蛋白变性。10%分离胶内每孔加入20-60μg蛋白样品,室温110V恒压电泳2小时,室温100V恒压电转移1小时将蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1小时,4℃一抗孵育过夜。次日PBST溶液润洗PVDF膜3次,每次10分钟,室温二抗孵育1小时,PBST溶液再次润洗PVDF膜3次,每次10分钟后ECL系统曝光。Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)软件定量分析样品蛋白浓度,并以β-actin浓度标化。4、制备脑组织切片,免疫组织化学染色多聚甲醛溶液固定的自闭症患者及正常对照儿童的脑组织标本同样购自NICHD发育障碍患者脑和组织库(NICHD Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders)。组织标本送至Department of histology, New York Institute for Basic Research制作石蜡切片。制作程序包括洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片和烤片。二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5分钟,100%酒精Ⅰ、Ⅱ、85%酒精、50%酒精、25%酒精、TBS依顺序每缸中浸泡5分钟。10%H202-甲醇封闭内源性过氧化物酶20分钟,再转至TBS中浸泡5分钟。切片置于湿盒内,每张切片加3滴5%BSA封闭液,室温下孵育30分钟,弃去多余液体,不洗。每张切片滴加3滴一抗,置于湿盒中4℃孵育过夜。TBS冲洗切片5分钟,滴加二抗,湿盒中室温孵育30分钟。TBS冲洗切片5分钟,滴加ABC液,湿盒中室温孵育45分钟。TBS冲洗切片5分钟,滴加DBS溶液显色5-25分钟。TBS,25%,50%,80%,100%梯度酒精顺序脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。Nikon eclipse 90i显微镜观察切片,Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)软件分析图像。5、统计分析统计分析使用SPSS 13.0软件完成。两组比较采用独立t检验。P<0.05则差异有统计学意义。[结果]1、自闭症患儿大脑皮质组织中RAS蛋白表达水平显著升高我们利用Western blot分别检测了自闭症患儿及正常对照儿童大脑皮质及小脑组织中RAS蛋白的表达水平。自闭症患儿大脑皮质组织中RAS蛋白条带明显强于对照组标本。定量分析结果显示,与对照组相比,自闭症患儿大脑皮质组织中RAS蛋白表达水平增加17.91%(t=-2.784,P=0.019),而小脑组织中RAS蛋白表达水平两组无显著差异(t=-1.758,P=0.109)。2、自闭症患儿大脑皮质及小脑组织C-Raf蛋白磷酸化/活性显著升高Raf激酶是RAS蛋白的下游底物,目前发现哺乳动物细胞中存在3种Raf激酶,即A-Raf, B-Raf和C-Raf (AKA.Raf-1).我们分别检测了自闭症患儿及正常对照儿童脑组织中A-Raf, B-Raf和C-Raf总蛋白的表达水平,以及磷酸化蛋白含量。实验结果显示,两组A-Raf(t=1.207,P=0.255)和B-Raf(t=-0.020, P=0.984),总蛋白及磷酸化A-Raf(t=0.703, P=0.498)和B-Raf(t=-0.011,P=0.991)的含量无显著差异。但与正常对照组相比,自闭症患儿大脑皮质及小脑组织中磷酸化/活化的C-Raf含量分别增加64.10%(t=-3.662,P=0.006)和42.20%(t=-2.677,P=0.042),而C-Raf总蛋白水平无明显变化(P<0.05)。3、自闭症患儿大脑皮质中MEK1/2蛋白活性显著升高MEK1/2是处于下游的Raf激酶的底物。因前述实验结果显示自闭症患儿大脑皮质Raf激酶活性显著高于对照,我们推测磷酸化MEK1/2蛋白含量亦相应升高。Western blot结果显示,自闭症患儿大脑皮质磷酸化/活化的MEK1/2蛋白含量比对照增加19.63%(t=-6.315,P<0.001),而MEK1/2总蛋白含量无显著变化(t=1.590,P=0.143)。使用磷酸化MEK1/2抗体进行免疫组化染色的结果与Westernblot结果吻合,自闭症患儿大脑皮质阳性神经元数量显著多于对照(t=5.320,P<0.001)。此外,我们还检测了自闭症患儿小脑组织中MEK1/2总蛋白和磷酸化蛋白的含量,但与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。4、自闭症患儿大脑皮质ERK1/2蛋白表达水平上调我们最后检测了自闭症患儿大脑皮质及小脑组织中ERK1/2蛋白表达水平。实验结果显示,与对照组儿童大脑皮质标本相比,自闭症患儿大脑皮质ERKl/2表达水平上调56.54%(t=-2.288,P=0.045)。但是Western blot、免疫组化以及ELISA均未检测到两组磷酸化ERK1/2蛋白水平变化,我们推测此结果是因为脑组织中ERK1/2磷酸化蛋白表达水平过低。[结论]本研究结果证实,与正常儿童相比,自闭症患儿脑组织中Ras/Raf/ERK1/2信号通路多个信号分子表达水平及/或活性异常上调,可能是自闭症发病的分子机制之一。第二章BTBR小鼠大脑皮质及小脑Ras/Raf/ERK1/2通路信号异常上调[目的]大量行为学研究报道BTBR T+tfJ (BTBR)小鼠表现出典型的自闭症样行为,符合自闭症诊断的三个核心标准,是研究自闭症的理想的动物模型。我们前述研究已经证实,自闭症患儿脑组织中Ras/Raf/ERK1/2通路信号异常上调。且既往研究报道mTOR信号通路与Ras/Raf/ERK1/2信号通路交互作用,在神经系统疾病的发病中起重要作用。本部分实验拟以BTBR小鼠为动物模型,进一步探讨Ras/Raf/ERK1/2和mTOR信号通路与自闭症发病的关系。[方法]1、制备小鼠脑组织匀浆标本及标本蛋白浓度测定BTBR T+tfJ (BTBR)及C57BL/6J (B6)成年(7周龄)小鼠各6只,购自Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA)。小鼠断头处死,快速分离大脑额叶皮质及小脑组织。脑组织标本置于冰匀浆缓冲液中充分匀浆。Bradford法测定标本蛋白浓度。2、Western blot比较小鼠大脑皮质及小脑组织中Ras/Raf/ERK1/2通路信号分子表达水平脑组织匀浆标本加以等体积SDS上样缓冲液(20%甘油,100mM Tris, pH 6.8,0.05% w/v溴酚蓝,2.5% SDS (w/v),250mM DTT),100℃加热5分钟使蛋白变性。10%分离胶内每孔加入20-60μg蛋白样品,室温110V恒压电泳2小时,室温100V恒压电转移1小时将蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1小时,4℃一抗孵育过夜。次日PBST溶液润洗PVDF膜3次,每次10分钟,室温二抗孵育1小时,PBST溶液再次润洗PVDF膜3次,每次10分钟后ECL系统曝光。Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)软件定量分析样品蛋白浓度,并以β-actin浓度标化。3、制备小鼠脑组织切片小鼠断头处死,手术剪剪下头部,去除头皮及颅骨,游离脑组织后置于4%多聚甲醛溶液中固定7天。组织标本送至Department of histology, New York Institute for Basic Research制作。包括洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片和烤片。4、免疫组织化学分析小鼠大脑皮质中Ras/Raf/ERK1/2通路信号分子分布二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5分钟,100%酒精Ⅰ、Ⅱ、85%酒精、50%酒精、25%酒精、TBS依顺序每缸中浸泡5分钟。10%H202-甲醇封闭内源性过氧化物酶20分钟,再转至TBS中浸泡5分钟。切片置于湿盒内,每张切片加3滴5%BSA封闭液,室温下孵育30分钟,弃去多余液体,不洗。每张切片滴加3滴一抗,置于湿盒中4℃孵育过夜。TBS冲洗切片5分钟,滴加二抗,湿盒中室温孵育30分钟。TBS冲洗切片5分钟,滴加ABC液,湿盒中室温孵育45分钟。TBS冲洗切片5分钟,滴加DBS溶液显色5-25分钟。TBS,25%,50%,80%,100%梯度酒精顺序脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。Nikon eclipse 90i显微镜观察切片,Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)软件分析图像。5、统计分析统计分析使用SPSS 13.0软件完成。两组比较采用独立t检验。P<0.05则差异有统计学意义。[结果]1、小鼠大脑皮质及小脑组织中Ras/Raf/ERK1/2通路信号分子表达水平上调1.1 BTBR小鼠大脑皮质及小脑组织RAS蛋白表达水平显著升高我们利用Western blot分别检测了BTBR小鼠和B6小鼠大脑皮质及小脑组织中RAS蛋白的表达水平。BTBR小鼠大脑皮质和小脑组织中RAS蛋白条带均明显强于对照组标本。定量分析结果显示,与对照组相比,BTBR小鼠大脑皮质和小脑组织RAS蛋白表达水平分别增加134.34%(t=-3.642,P=0.005)和73.79%(t=-4.482,P=0.001)。1.2 BTBR小鼠大脑皮质组织中磷酸化/活化的A-Raf, B-Raf和C-Raf蛋白含量显著升高实验结果显示A-Raf(t=1.297, P=0.233), B-Raf(t=-1.464, P=0.174)和C-Raf(t=1.182, P=0.264)总蛋白表达水平两组无统计学差异,而磷酸化/活化的A-Raf, B-Raf和C-Raf蛋白含量实验组分别比对照组增加94.82%(t=-5.441,P=0.002),167.95%(t=-7.693,P=0.001)和40.20%(t=-2.357,P=0.040)。使用磷酸化C-Raf抗体进行免疫组化染色的结果与Western blot结果吻合,BTBR小鼠大脑皮质阳性神经元数量显著多于对照组(t=2.877,P=0.007)。此结果说明与正常对照组相比,BTBR小鼠大脑皮质组织中三种Raf蛋白活性异常增高。1.3 BTBR小鼠小脑组织中磷酸化/活化的C-Raf蛋白含量显著升高我们进一步检测了BTBR及B6小鼠小脑组织中A-Raf, B-Raf和C-Raf总蛋白表达水平,以及磷酸化蛋白的含量。实验结果显示,A-Raf(t=-0.255, P=0.804), B-Raf(t=0.697, P=0.501)和C-Raf (t=-0.521,P=0.614)总蛋白表达水平两组无显著差异,且磷酸化A-Raf (t=-1.910, P=0.101)和B-Raf(t=-1.937, P=0.081)水平两组也无显著差异,此与大脑皮质类似。而BTBR小鼠小脑组织中磷酸化／活化的C-Raf含量比对照组增加58.27%(t=-4.532,P=0.001),但C-Raf,总蛋白水平无明显变化(t=-0.521,P=0.614)。此结果说明三种Raf激酶在BTBR小鼠大脑皮质和小脑有不完全相同的调节机制。1.4 BTBR小鼠大脑皮质磷酸化/活化的MEK1/2蛋白含量显著升高Western blot结果显示,BTBR小鼠大脑皮质磷酸化/活化的MEK1/2蛋白含量较对照组增加385.40%(t=-14.547,P<0.001),而MEK1/2总蛋白含量无显著变化(t=0.317,P=0.758)。使用磷酸化MEK1/2抗体进行免疫组化染色的结果与Western blot结果吻合,BTBR小鼠大脑皮质阳性神经元数量显著多于对照(t=10.425,P<0.001)。此外,我们还检测了BTBR小鼠小脑组织中MEK1/2总蛋白(t=0.007,P=0.995)和磷酸化蛋白(t=2.189,P=0.053)的含量,但与对照组相比无统计学差异。1.5 BTBR小鼠大脑皮质磷酸化/活化的ERK1/2蛋白含量显著升高我们进一步检测了BTBR小鼠大脑皮质组织中ERK1/2蛋白活性,该蛋白磷酸化由MEK1/2激酶催化形成。Western blot分析结果显示,与对照组B6小鼠大脑皮质标本相比,BTBR小鼠大脑皮质ERK1/2磷酸化水平上调54.92%(t=-7.842,P<0.001),而ERK1/2总蛋白表达水平与对照组无显著差异(t=-0.611,P=0.555)。免疫组化结果与Western blot结果一致(t=-12.041,P<0.001),进一步证明BTBR小鼠大脑皮质ERK1/2磷酸化水平上调。此外,我们同样检测了小脑组织中ERKl/2的水平,但与对照组相比,总蛋白(t=1.428,P=0.184)及磷酸化蛋白(t=0.255,P=0.804)的含量均无显著差异。2、小鼠大脑皮质及小脑组织中mTOR通路信号分子表达水平mTOR信号通路是控制细胞生长、增殖的另一重要信号通路,文献报道其与Ras/C-Raf/ERK1/2信号通路有交互作用。因此我们进一步检测了mTOR信号通路中3个主要信号分子。实验结果显示,与对照组B6小鼠大脑皮质标本相比,BTBR小鼠大脑皮质Akt, mTOR和p70 S6蛋白磷酸化水平分别上调32.91%(t=-2.802, P=0.035),112.44%(t=-10.495, P<0.001)和41.5%(t=-3.226,P=0.022),而Akt (t=1.924, P=0.101), mTOR (t=1.198, P=0.259)和p70 S6(t=-0.689,P=0.514)总蛋白表达水平与对照组均无显著差异。[结论]实验结果显示,BTBR小鼠大脑皮质及小脑组织Ras/Raf/ERK1/2通路信号异常上调,与人脑组织标本检测结果一致,进一步证实Ras/Raf/ERK1/2信号通路可能为自闭症发病的分子机制。此外,BTBR小鼠脑组织中mTOR通路信号分子表达水平及活性亦异常升高,提示其可能在自闭症发病中起一定作用,但其与Ras/Raf/ERK1/2信号通路的相互作用机制有待进一步研究。第三章MEK抑制剂U0126和mTOR抑制剂rapamycin部分纠正BTBR小鼠大脑皮质神经细胞异常行为[目的]如前所述,我们已经证实BTBR小鼠脑组织中Ras/Raf/ERK1/2通路及mTOR通路信号异常上调,该变化在大脑皮质组织中尤为明显,提示可能为自闭症发病的分子机制。本部分实验拟利用MEK1/2抑制剂U0126和mTOR抑制剂rapamycin特异性抑制小鼠大脑皮质神经细胞中上述两条通路活性,研究其对神经细胞行为的影响,初步探讨其对自闭症的治疗作用。[方法]1、小鼠原代大脑皮质神经细胞培养麻醉妊娠16天BTBR和B6小鼠,剖宫取出胚鼠,无菌操作台上分离胚鼠大脑皮层组织,胰酶消化,细胞悬液离心、重悬后计数,调整细胞终浓度为1×106个细胞/ml。多聚赖氨酸包被的培养皿中加入细胞悬液2m1,置于37℃温箱中孵育过夜。次日更换培养液为完全培养液,此后每3日更换培养液直至实验。2、兴奋性/抑制性突触比值PBS缓冲液冲洗细胞3次,800μl封闭液室温封闭45分钟。弃去封闭液后加入一抗4℃孵育过夜。次日PBS冲洗3次后加入二抗室温避光孵育1小时。PBS冲洗3次,每张载玻片滴加1滴ProLong Gold antifade reagent封片。Nikon eclipse 90i显微镜观察拍片,Image J软件分析图像。每项指标至少测量500个细胞。3、U0126及rapamycin对信号通路抑制作用比较3.1相同作用时间,不同浓度U0126抑制Ras/Raf/ERK1/2信号通路实验组细胞培养液中分别加入U0126使其终浓度为10μM,20μM和30μM,对照组培养液中加入0.1%DMSO。37℃温箱中孵育60分钟。移除培养液,PBS冲洗3次,每次5分钟。37℃胰蛋白酶消化5分钟,完全培养基终止消化。置于离心管中1000rpm离心5分钟,去上清,每管加入200μ1匀浆缓冲液匀浆。Bradford法测定蛋白浓度。每孔加入20μg蛋白电泳测定相关蛋白表达水平。相同实验重复3次。3.2相同作用时间,不同浓度rapamycin对mTOR信号通路的影响实验组细胞培养液中分别加入rapamycin使其终浓度为0.1μM, 1μM和10μM,对照组培养液中加入0.1%DMSO。37℃温箱中孵育60分钟。移除培养液,PBS冲洗3次,每次5分钟。37℃胰蛋白酶消化5分钟,完全培养基终止消化。1000rpm离心5分钟,去上清,每管加入200μ1匀浆缓冲液匀浆。Bradford法测定蛋白浓度。每孔加入20μg蛋白电泳测定相关蛋白表达水平。相同实验重复3次。3.3 U0126和rapamycin联合作用对信号通路的影响根据前述实验结果确定U0126和rapamycin实验浓度分别为10gM和0.1μM。实验组细胞培养液中分别加入U0126和/或rapamycin,对照组培养液中加入0.1%DMSO。37℃温箱中孵育60分钟。移除培养液,PBS冲洗3次,每次5分钟。37℃胰蛋白酶消化5分钟,完全培养基终止消化。1000rpm离心5分钟,去上清,每管加入200μ1匀浆缓冲液匀浆。Bradford法测定蛋白浓度。每孔加入20μg蛋白电泳测定相关蛋白表达水平。相同实验重复3次。4、U0126和Rapamycin对神经细胞行为的影响4.1 U0126和Rapamycin处理细胞实验组细胞培养液中加入10μM U0126和/或0.1μM Rapamycin,对照组培养液中加入0.1%DMSO。37℃温箱中孵育60分钟。移除培养液,PBS冲洗3次,每次5分钟。37℃胰蛋白酶消化5分钟,完全培养基终止消化。1000rpm离心5分钟,去上清,重悬细胞并计数。4.2细胞黏附实验预包被重组ICAM-1的96孔板,每孔加入5000个细胞,37℃温箱中孵育1.5小时。移除未贴附的细胞,重新加入等量培养基,colorimetric aqueous MTS assay测定黏附细胞数量。4.3细胞迁移实验Fluorescent Calcein AM (2.5μM)染料与细胞共同孵育20分钟。24孔板上半部分加入0.8m1 1%血清的MEM培养基和HTS FluoroBlock insert,每孔加入10,000个细胞,37℃孵箱中孵育3小时后将FluoroBlock insert移到5%FBS的孔中。37℃孵箱中孵育2小时后吸取5%FBS孔中培养基测定吸光度(microfluorimetric plate reader, CytoFluor 4000. MTX Lab Systems)。4.4 U0126对神经细胞树突形成的影响实验组细胞培养液中加入10μM U0126,对照组培养液中加入0.1%DMSO。每日更换培养液防止细胞代谢物及药物堆积。37℃温箱孵育3日后染色。室温4%多聚甲醛固定细胞15分钟,37℃与Vybrant-Dil cell-labeling solution(1：200)孵育25分钟。PBS冲洗3次,每次10分钟。4℃培养基孵育过夜。次日取出载玻片,每张载玻片滴加1滴ProLong Gold antifade reagent封片。Nikon Eclipse E800显微镜观察拍片,Image J软件分析图像。计数200个神经细胞,计算每50μm成熟树突(蘑菇状、头部比颈部宽50%以上的树突视为成熟树突)数目。5、统计分析统计分析使用SPSS 13.0软件完成。所有图表资料以均数±标准差表示。两组间突触荧光强度比较采用独立t检验。同一细胞系对不同抑制剂浓度的反应采用one-way ANOVA比较总体差异,有显著性差异的数据进一步进行组间多重比较；不同细胞系之间同一处理剂量比较采用独立t检验。两种抑制剂处理后细胞蛋白表达水平比较采用析因设计的方差分析。细胞黏附实验和迁移实验同一细胞系内不同处理方法比较采用析因设计的方差分析；不同细胞系对相同处理方法比较采用独立t检验。同一细胞系内不同处理及同一处理对不同细胞系树突棘生长的影响比较采用独立t检验。P<0.05则差异有统计学意义。[结果]1、兴奋性/抑制性突触比值分别使用Synaptophysin, VGLUT1和VGAT对BTBR和B6小鼠大脑皮质神经细胞进行荧光染色。与对照组相比,BTBR小鼠大脑皮质神经细胞Synaptophysin荧光强度低32.06%t=10.536, P<0.001); BTBR小鼠大脑皮质神经细胞VGLUT1荧光强度低23.98%(t=7.525,P<0.001); BTBR小鼠大脑皮质神经细胞VGAT荧光强度低16.18%(t=5.982, P<0.001); BTBR小鼠大脑皮质神经细胞VGLUT1/VGAT比值降低11.16%(t=-2.444,P=0.015)。2、U0126及rapamycin对信号通路抑制作用比较2.1相同作用时间,不同浓度U0126对Ras/Raf/ERK1/2信号通路的影响B6组内比较p-ERK活性,总体差异有统计学意义(F=12.159,P=0.002)。U012610μM组比对照组降低10.55%(P=0.036); U0126 20μM组比对照组降低9.81%(P=0.047); U0126 30μM组比对照组降低25.07%(P<0.001)。BTBR组内比较p-ERK活性,总体差异有统计学意义(F=92.189, P<0.001)。U0126 10μM组比对照组降低30.14%(P<0.001); U0126 20μM组比对照组降低36.40%(P<0.001); U0126 30μM组比对照组降低66.00%(P<0.001)。B6和BTBR组间比较p-ERK活性,BTBR对照组比B6对照组增加14.84%(t=-3.143, P=0.035); BTBR U0126 10μM组比B6 U0126 10μM组降低10.31%(t=5.335, P=0.006); BTBR U0126 20μM组比B6 U0126 20μM组降低19.40%(t=5.114, P=0.028); BTBR U0126 30μM组比B6 U0126 30μM组降低32.54%(t=4.529,P=0.011)。各组间比较ERK表达水平,B6组(F=0.223,P=0.878)及BTBR组(F=0.403,P=0.755)差异均无统计学意义。2.2相同作用时间,不同浓度rapamycin对mTOR信号通路的影响B6组内比较p-p70 S6活性,总体差异有统计学意义(F=83.488,P<0.001)。rapamycin 0.1μM组比对照组降低20.11%(P=0.007)；rapamycin 1μM组比对照组降低39.97%(P<0.001); rapamycin 10μM组比对照组降低84.34%(P<0.001)。BTBR组内比较p-p70 S6活性,总体差异有统计学意义(F=122.582,P<0.001)。rapamycin 0.1 uM组比对照组降低31.74%(P<0.001); rapamycin 1μM组比对照组降低40.03%(P<0.001); rapamycin 10μM组比对照组降低54.98%(P<0.001)。B6和BTBR组间比较p-p70 S6活性,BTBR对照组比B6对照组降低33.74%(t=6.853, P=0.002); BTBR rapamycin 0.1μM组比B6 rapamycin 0.1μM组降低43.38%(t=18.555, P<0.001); BTBR rapamycin 1μM组比B6 rapamycin 1μM组降低33.80%(t=4.641, P=0.035); BTBR rapamycin 10μM组比B6 rapamycin 10μM组增加90.48%(t=-2.944,P=0.042)。各组间比较p70 S6表达水平,B6组(F=0.531,P=0.674)及BTBR组(F=1.573,P=0.270)差异均无统计学意义。2.3 U0126和rapamycin联合作用对B6小鼠大脑皮质细胞Ras/Raf/ERK1/2信号通路的影响比较两种抑制剂对B6皮质神经细胞中p-ERK活性的影响,单独使用U0126(F--5.666,P=0.045)或者rapamycin(F=57.996, P<0.001),以及联合使用两种抑制剂(F=18.050,P=0.003)均显著降低B6皮质神经细胞中p-ERK活性。比较两种抑制剂对B6皮质神经细胞中p-p70 S6活性的影响,U0126对p-p70S6活性无显著影响(F=0.058,P=0.816)；rapamycin单独使用(F=1407.240,P<0.001)或者联合使用U0126(F=6.116,P=0.039)均显著抑制p-p70 S6活性。U0126和／或]rapamycin对ERK及p70 S6表达水平无显著影响(P>0.05)。2.4 U0126和rapamycin联合作用对BTBR大脑皮质细胞Ras/Raf/ERK1/2信号通路的影响比较两种抑制剂对BTBR皮质神经细胞中p-ERK活性的影响,单独使用U0126(F=819.866,P<0.001)或者rapamycin(F=951.046, P<0.001),以及联合使用两种抑制剂(F=727.075,P<0.001)均显著降低BTBR皮质神经细胞中p-ERK活性。比较两种抑制剂对BTBR皮质神经细胞中p-p70 S6活性的影响,单独使用U0126(F=74.390,P<0.001)或者rapamycin(F=11038.788, P<0.001),以及联合使用两种抑制剂(F=33.265,P<0.001)均显著抑制p-p70 S6活性。U0126和/或rapamycin对ERK及p70 S6表达水平无显著影响(P>0.05)。3、细胞黏附实验比较两种抑制剂对B6皮质神经细胞黏附能力的影响,单独使用rapamycin对神经细胞黏附能力无显著影响(F=0.917,P=0.353)。单独使用U0126(F=6.296,P=0.023)或者联合使用两种抑制剂(F=10.114,P=0.006)均显著增加B6皮质神经细胞黏附能力。比较两种抑制剂对BTBR皮质神经细胞黏附能力的影响,单独使用rapamycin对神经细胞黏附能力无显著影响(F=2.101,P=0.167)。单独使用U0126(F=10.576,P=0.005)或者联合使用两种抑制剂(F=4.920,P=0.041)均显著增加B6皮质神经细胞黏附能力。B6和BTBR组间比较,BTBR对照组比B6对照组降低66.57%(t=12.704,P<0.001); BTBR rapamycin组比B6 rapamycin组降低60.55%(t=9.773,P<0.001)；BTBR U0126组比B6 U0126组降低57.49%(t=6.833, P<0.001); BTBR U0126和rapamycin组比B6 U0126和rapamycin组降低55.05%(t=8.529,P=0.001)。4、细胞迁移实验比较两种抑制剂对B6皮质神经细胞迁移能力的影响,单独使用U0126(F=65.581,P<0.001)或者rapamycin(F=6.414, P=0.035),以及联合使用两种抑制剂(F=8.913,P=0.017)均显著增加B6皮质神经细胞迁移能力。比较两种抑制剂对BTBR皮质神经细胞迁移能力的影响,单独使用U0126(F=25.525,P=0.001)或者rapamycin(F=32.940, P<0.001),以及联合使用两种抑制剂(F=5.597,P=0.046)均显著增加BTBR皮质神经细胞的迁移能力。B6和BTBR组间比较,BTBR对照组比B6对照组降低28.88%(t=3.217,P=0.032); BTBR rapamycin组比B6 rapamycin组降低27.22%(t=3.572,P=0.023)；BTBR U0126组比B6 U0126组降低46.05%(t=10.928, P<0.001); BTBR U0126和rapamycin组比B6 U0126和rapamycin组降低37.34%(t=8.396,P=0.013)。5、U0126对树突棘形成的影响Dil染色结果提示,BTBR皮质神经细胞树突棘密度比B6神经细胞少62.92%(t=7.006,P<0.001)。U0126可显著促进BTBR皮质神经细胞树突棘的生成。使用U0126 10μM培养BTBR皮质神经细胞3天后,BTBR皮质神经细胞树突棘密度比BTBR未处理组增加251.61%(t=7.894,P<0.001),但仍低于B6处理组28.75%(t=2.475,P=0.016)。U0126 10μM培养B6神经细胞3天后树突棘密度较对照组增加83.58%(t=4.188,P<0.001)。此结果说明U0126对神经细胞发育及突触形成有促进作用。[结论]MEK抑制剂U0126和mTOR抑制剂rapamycin可抑制BTBR小鼠大脑皮质细胞Ras/Raf/ERK1/2和mTOR信号通路过度上调,部分纠正BTBR小鼠大脑皮质神经细胞各种异常行为,提示其对自闭症的治疗可能有一定作用。全文小结1、与正常儿童相比,自闭症患儿脑组织中Ras/Raf/ERK1/2信号通路多个信号分子表达水平及／或活性异常上调,可能是自闭症发病的分子机制之一。2、BTBR小鼠大脑皮质及小脑组织Ras/Raf/ERK1/2通路信号异常上调,与人脑组织标本检测结果一致,进一步证实Ras/Raf/ERK1/2信号通路可能为自闭症发病的分子机制。此外,BTBR小鼠脑组织中mTOR通路信号分子表达水平及活性亦异常升高,提示其可能在自闭症发病中起一定作用。3、MEK抑制剂U0126和mTOR抑制剂rapamycin可抑制BTBR小鼠大脑皮质神经细胞Ras/Raf/ERK1/2和mTOR信号通路过度上调,部分纠正BTBR小鼠大脑皮质神经细胞各种异常行为,提示其对自闭症的治疗可能有一定作用。