尖吻蝮蛇蛇毒中非成瘾性止痛剂的研究 疼痛是 许多疾病的症状，是机体受伤害性刺激的一种保护性反应。疼痛又是一种主观体验，主要由感觉不适和相应的情感反应构成。普通止痛药（去痛片）长期滥用极易成瘾，产生耐受性。寻找新的无成瘾性止痛剂具有十分重要的意义。蛇毒是蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂的混合物。含有多种蛋白质、多肽、酶类和其它小分子物质，具有广泛的生物学活性。蛇毒替代吗啡用于癌症晚期的镇痛已有应用并已有止痛有效产品从眼镜蛇毒(Naja naja)中分离得到，由于它具有更高的镇痛活性，且无成瘾性，有可能成为吗啡的重要替代品。利用 CHO-μ受体细胞筛选阿片受体激动剂是从中发现新的镇痛剂和戒毒药的便捷方法。 镇痛药可分为两类：麻醉性镇痛药即阿片类药物，主要作用于中枢，用于锐痛（不能承受的疼痛）如吗啡；解热镇痛药，主要作用于外周，用于钝痛（能承受的疼痛）如阿司匹林。阿片类药物系天然的阿片生物碱或其半合成的衍生物，能与阿片受体结合并产生激动效应。最近人们克隆出四种典型的阿片类受体 μ、δ、κ 和σ，并确定了其核苷酸序列。阿片受体属于 G 蛋白耦联受体大类。阿片受体各亚型发挥作用的细胞内信号机理大致相同，阿片类药物之所以具有不同的药理作用，可能主要与相应亚型受体的分布不同有关。阿片受体的内源性配体为脑啡肽、内啡肽和强啡肽，它们分别由不同的基因编码。一般认为，μ 受体与镇痛作用有密切关系，在 μ 受体缺陷小鼠，给予吗啡，未观察到有任何镇痛作用。σ受体激动则不产生镇痛效应，δ 和 67<WP=73>吉林大学硕士学位论文 中文摘要κ 受体可能与镇痛作用关系不大。因此本研究选择 μ 受体作为从蛇毒中筛选新镇痛剂的工具。 活细胞可以吸收糖类营养物质如葡萄糖，并将它们转化成能量供生理需要，同时产生代谢物。细胞主要的代谢物为乳酸和碳酸。细胞向周围环境中排泄酸性代谢物的速度和它将营养物质转化成能量即新陈代谢的速度密切相关。细胞表面受体的激发物质对细胞具有瞬间的直接反应，而对于特殊的与受体亲和力强的配体与受体可稳定的结合（如神经递质与细胞表面的受体结合），引起胞内多个代谢途径的变化，从而引起细胞产酸速度的变化。本研究通过蛇毒层析洗脱液与 CHO 细胞上的μ阿片受体反应，用 CytosensorMicrophysiometer System 测量细胞培养基环境中变酸速度，来检验蛇毒成分与μ受体的亲和力，筛选μ阿片受体激动剂。小鼠醋酸扭体镇痛实验证明其具有强镇痛活性，小鼠竖尾和跳跃实验证明其无成瘾性，提示了 CHO-μ受体细胞应用于无成瘾性镇痛药物筛选的可行性。 目前发现的蛇毒液中止痛作用有效成分均是其中的神经毒素类。一般蛇毒神经毒素用于临床止痛具有无成瘾性，无赖药性，且药效较常用吗啡类药强的特点。国外有报道称，纳洛酮能有效地阻断除从 Naja naja atra 分离出的眼镜蛇毒素以外的其它的神经毒及吗啡的镇痛作用。但是一些神经毒如响尾蛇胺（crotamine）和 hannalgesin 分子中并不存在—Tyr—Gly—Gly—Phe—的氨基酸顺序，而这一氨基酸顺序几乎存在于所有的内源性阿片肽，包括脑啡肽、内啡肽及强啡肽，因此这类神经毒并非直接作用于阿片受体。推测蛇神经毒（NT）引起脑内脑啡肽含量升高可能是一种继发反应，机理尚不清楚。本研究从蛇毒中分离得到的具有体内镇痛活性的μ阿片受体激动剂在小白鼠毒性实验中，尾静脉和腹腔注射 9 mg/kg，大约是醋酸扭体镇痛实验有效剂量（背部皮下注射 0.25 mg/kg）的 36 倍，未观察到神经毒中毒症 68<WP=74>吉林大学硕士学位论文 中文摘要状，因此推测此μ阿片受体激动剂与神经毒素镇痛机制不同，其镇痛机制正在研究当中。 本研究利用 CHO-μ受体细胞在尖吻蝮蛇蛇毒中筛选纯化得到μ阿片受体激动蛋白，SDS-PAGE 凝胶电泳和 HPLC 均呈现单一组分，PAS 反应阴性，因此不含有糖基。氨基酸分析显示，它共含有 149 个氨基酸残基，其中以Glu、Ala、Asp、Ser、Trp、Lys 及 Phe 的含量较多，不含 CysH，计算此蛋白相对分子质量为 20 kDal，与 SDS-PAGE 凝胶电泳结果一致，只有一条肽链组成。经测定我们获得的μ阿片受体激动蛋白不具有蛋白水解酶活性、精氨酸酯酶活性、纤溶酶活性、凝血酶活性、胆碱酯酶活性和出血毒活性。具有 PLA2 活性，这些酶学及生物学性质的测定给以后的药理学评价研究奠定了基础。 小白鼠毒性实验中，尾静脉和腹腔注射 9 mg/kg，大约是醋酸扭体镇实验有效剂量的 36 倍，未出现中毒症状及死亡，此剂量下用药是安全 的，其毒性正处于研究之中。 本研究表明，利用 CHO-μ受体细胞在天然资源中筛选无成瘾性镇痛剂是可行的。阿片受体激动剂是目前国外常用的戒毒药，其控制症状彻底，无明显不良反应，本研究纯化得到的μ阿片受体激动蛋白可能成为一种新型的戒毒药。进一步的实验正在进行中。