黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤,占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分,患者早期症状隐匿,一旦发现多数已发生转移,无法手术切除,故死亡率极高。随着肿瘤免疫学的进展,人们对肿瘤抗原、肿瘤免疫逃逸机制和肿瘤微环境的认识的深入,免疫治疗逐渐成为肿瘤治疗和研发领域的关注点：即通过激发或调动机体的免疫系统,增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力,从而控制和杀伤肿瘤细胞[2,3]。特别是近期抗PD-1和抗CTLA-4的单克隆抗体的应用,在免疫治疗黑色素瘤的疗效方面有了突破性进展[4-6]。细胞因子疗法也是肿瘤免疫治疗的一个重要途径,即通过某种方式使需要的细胞因子水平增加,充分发挥某细胞因子抗肿瘤的生物学作用。大量的临床数据表明,虽然免疫治疗的应用,使黑色素瘤的疗效明显提高,但仍有部分患者最后出现恶性复发[7-9]。治疗失败的原因之一是由于黑色素瘤细胞分泌大量的转化生长因子β (transforming growth factor β, TGF-β),抑制了机体免疫功能,并促使癌细胞的转移。IL-21是2000年发现的属IL-2细胞因子家族的新成员,由活化的CD4+T辅助细胞产生,其受体表达在多种免疫细胞(B、T、NK细胞)上,因此对多种免疫细胞有重要的生物调节作用。IL-21能提高B淋巴细胞的增殖,提高IgG1的产生,从而调节人体体液免疫。IL-21还可增强NK细胞、T淋巴细胞的增殖与杀伤功能,从而增强人体的细胞免疫(图1,图2)。在肿瘤的免疫治疗方面,无论是重组IL-21,还是表达IL-21的肿瘤疫苗,无论是单.药治疗还是联合应用,IL-21都表现出了较强的抗肿瘤作用[12-14]。本实验组自2001年开始从事IL-2的研究，并在国内首次扩增出小鼠的IL-21编码基因，序列已于2003年递交Gene Bank(登录号：AY428262)。我们在前期研究中发现，IL-21在小鼠黑色素瘤等多种肿瘤中可诱导较强的抗肿瘤作用,黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21可增强免疫小鼠NK细胞和CTL的细胞毒功能,抑制Treg细胞及其对CD8+T细胞的抑制作用,同时增加T细胞分泌IFN-Y的能力；增加的IFN-γ具有直接抗肿瘤活性,并可减少TGF-β的表达,进而抑制TGF-β诱导的Smad3的磷酸化,即Smad3和Smad4结合、Smad3的核内积聚以及TGF-β应答元件的活化,从而明显降低肿瘤细胞的侵袭性。然而,GPI-IL-21毕竟不能直接作用于TGF-3/Smad信号通路,因此不能完全阻断黑色素瘤的转移。微小RNA(microRNA)是由基因组编码的小分子RNA,长度为22nt左右,由核内和胞内酶分别从折叠的发夹状转录前体约为68个碱基RNA上切割形成,其功能发挥依赖于niRNA通过碱基配对结合到靶基因mRNA的3’UTR,通过抑制核糖体功能、降解靶基因mRNA等进而调控mRNA的转录与翻译功能。上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象,上皮来源的肿瘤可借助EMT发生远处转移。黑色素瘤虽然不是上皮来源的,但瘤细胞具有上皮样的特征,如易发生EMT而转移。锌指增强子结合蛋白1 (zinc-finger E-box binding homeobox 1, ZEB1)是上皮性钙黏蛋白(E-cadherin)转录抑制因子,具有典型的锌指结构,可以和靶基因E-Cadherin启动子区的E-box结合,抑制E-Cadherin的转录表达,导致细胞间粘附性降低、移动性和转移性增强。已有研究显示,一方面miR200c能够抑制ZEB1和ZEB2表达,另一方而,ZEB1和ZEB2亦能在转录水平抑制miR200c的表达,专司上皮特性的miR200c和专司间质特性的ZEB家族构成了一个双向反馈调节回路,在调控结肠癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。此外,过表达miR200c可以阻断TGF-β诱导的EMT。因此,这一领域研究成为肿瘤靶向治疗关注点。以往研究显示,细胞因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-21等作为肿瘤瘤苗的免疫增强剂,仅限于其对免疫细胞的活化反应,但针对肿瘤细胞及其相关的信号通路的研究有限；调节肿瘤细胞本身的信号通路,从而影响其生物学特性,这对肿瘤疫苗诱导的免疫反应所发挥的免疫治疗作用有重要影响。由此我们设想,如果能直接下调黑色素瘤细胞中TGF-β1的表达,并通过不同途径调节miR200和ZEB1的表达,可能会与黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21产生协同和增强作用。该策略应用,一方而能提高机体免疫系统针对肿瘤细胞的免疫攻击效应,另一方面能降低或阻止黑色素瘤的侵袭和转移,从而发挥更好的抗肿瘤效果。为此,本论文进行了如下系列实验研究。一.目的：通过调节miR200c、ZEB1及TGF-p 1靶分子表达,加强黑色素瘤B16F10/GPI-IL-21瘤苗的抗肿瘤效应,为肿瘤疫苗免疫治疗黑色素瘤研究提供实验依据和新的思路。二.方法：1. B16F10/GPI-IL-21瘤苗联合miR200c 和 shZEB1的抗肿瘤效应及其相关机制研究1)将实验室前期构建的质粒pSUPER-EGFP 1-shZEB 1 (shZEB 1)和pcDNA3.1/ GPI-IL-21,脂质体转染小鼠B16F10细胞,G418筛选稳定转染的阳性克隆,分别命名为B16F10/shZEB1 和 B16F10/GPI-IL-21,并通过QRT-PCR和Western-blot鉴定靶分子表达；将过表达miR200c的核心质粒与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G,通过脂质体共转染人胚肾HEK-293T细胞,回收上清,通过超高速离心法收集病毒并感染B16F10细胞,最后用极限稀释法筛选出稳定表达miR200c的细胞株,命名为B16F10/miR200c,通过RT-PCR检测稳定感染细胞中miR200c和ZEB1的表达；以野生型B16F10细胞为对照, 通过Western-blot检测B16F10/shZEB1、B16F10/GPI-IL-21和B16F10/miR200c中ZEB1、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Smad7等EMT相关分子的表达,并用划痕实验、平板克隆形成实验检测其迁移能力和克隆形成能力；2)分别给予C57BL/6小鼠腹股沟处皮下接种丝裂霉素C (MMC, 100μg/ml)灭活的B16F10/细胞1×107/只／周,在免疫后0、1、2、3、4周小鼠眼静脉采血,双抗夹心ELISA法检测瘤苗免疫鼠血清中IFN-γ、IL-4和TGF-p的分泌,流式细胞术检测免疫鼠脾细胞的细胞毒活性；第3次免疫后1周将小鼠随机分组,每组6只,分别于小鼠背部皮下攻击野生株B16F10、B16F10/ shZEB1、 B16F10/GPI-IL-21和B16F10/miR200c细胞1×105/只,观察皮下肿瘤出现的时间、大小、远处转移情况以及小鼠的生存期等；HE染色比较各组小鼠的肺部转移情况,免疫组化和Western-blot检测相应肿瘤组织中EMT相关因子的表达情况。2shZEB1质粒和miR200c agomir小鼠体内接种以增强B16F10/GPI-IL-21瘤苗的抗黑色素瘤效应及其机制研究1)小鼠免疫方法同前,第三次免疫结束后分别于小鼠背部皮下攻击野生株B16F10细胞1×105／只,攻击后3天,将小鼠随机分三组,分别以PBS、shZEB1质粒和miR200c agomir治疗,4天／次×6；2)治疗结束后小鼠眼静脉采血,双抗夹心ELISA法检测瘤苗免疫鼠血清中IFN-y和TGF-p水平；处死部分小鼠,流式细胞术检测各组荷瘤鼠的NK和CTL细胞毒活性以及脾脏和肿瘤引流淋巴结中CD4+CD25+Treg细胞的比例；观察皮下肿瘤出现的时间、大小、远处转移情况以及小鼠的生存期等；HE染色比较各组小鼠的肺部转移情况,免疫组化和Western-blot检测相应肿瘤组织中EMT相关分子的表达。3.下调TGF-p1表达联合miR200c agomir增强黑色素瘤苗B16F10/GPI-IL-21的抗肿瘤效应及其机制研究1)用pSUPER-EGFP1载体构建针对小鼠shTGF-β1基因的干扰质粒pSUPER-EGFP1-shTGF-β1(shTGF-p 1),用脂质体将其转染B16F10细胞,G418筛选稳定转染细胞株,并命名为B16F10/shTGF-β1,定量QRT-PCR检测干扰效率,Western-blot检测B16F10/shTGF-β1细胞中EMT相关分子的表达情况；通过克隆形成、划痕实验和侵袭实验检测其克隆形成能力、侵袭能力和迁移能力。2)按上述方法免疫小鼠,免疫后随机分为B16F10/GPI-IL-21+B16F10/shTGF-β1组,(1×105 B16F10/shTGF-β1细胞小鼠皮下成瘤),B16F10/GPI-IL-21+B16F10/shTGF-β1+miR200c组(1×105B16F10/shTGF-β1细胞小鼠皮下成瘤,同时以niR200c agomir治疗),B16F10/GPI-IL-21+ B16F10/Scrambled+ miR200c/Scrambled 组(1×105 B16F10/Scramble细胞小鼠皮下成瘤,同时以miR200c/Scramble治疗)；以两组未免疫鼠为对照,分别为B16F10/shTGF-β1组(1×105 B16F10/shTGF-β1细胞小鼠皮下成瘤)、B16F10/shTGF-β1+miR200c组(1×105 B16F10/shTGF-β1细胞小鼠皮下成瘤,并以miR200c agomir治疗)。观察各组小鼠肿瘤出现的时间、生长速度、远处转移情况以及小鼠的生存时间等；HE染色比较各组小鼠肿瘤的转移情况,免疫组化和Western-blot检测相应肿瘤组织中 EMT相关分子的表达。三.结果1) B16F10/GPI-IL21瘤苗免疫后,小鼠血清中IFN-γ、IL-4和TNFa的含量显著升高,脾细胞的CTL毒性也明显增强,而TGF-p含量下降。与对照组相比,实验组小鼠的成瘤率、肿瘤生长速度以及肺转移程度都明显降低,小鼠的生存周期也显著延长。免疫组化和Western-blot检测结果显示,各实验组的肿瘤组织中TGF-p. ZEB1和N-Cadherin的表达都明显降低,而E-Cadherin和Smad7的表达明显增加,与对照组相比,差异有显著性意义。2) 以B16F10/GPI-IL21瘤苗免疫小鼠后,用B16F10攻击小鼠,再用shZEB1质粒和niR200c agomir治疗后,小鼠的NK和CTL细胞毒活性明显增强,肿瘤引流淋巴结中CD4+CD25+Treg细胞的比例显著降低,小鼠的成瘤率、肿瘤生长速度和肺部转移情况明显下降,免疫组化和Western-blot检测结果显示,肿瘤组织中上皮相关分子表达量增加,而间质表型的分子表达量下降,与对照组相比,差异有显著性意义。3)用下调TGF-β1表达的B16F10细胞攻击B16F10/GPI-IL-21瘤苗免疫后小鼠,以miR200c agomir治疗后显示,该法诱导了更强的免疫反应,与对照组相比,差异有显著性意义。如增强小鼠NK细胞和CTL的细胞毒功能；更强的抑制Treg细胞的特异性标志即FoxP3的表达,且改变了Treg细胞对CD8+T细胞的抑制作用等；促进NK细胞和CD8+T细胞分泌IFN-y的能力增强并有效降低了血清中TGF-β的水平。小鼠的成瘤率、肿瘤生长速度以及肺转移程度都明显低于前两部分实验结果,小鼠生存期明显延长。四.结论通过调节黑色素瘤细胞或肿瘤微环境中miR200c、ZEB1 及 TGF-β1表达,能明显增强B16F10/GPI-IL21瘤苗的抗黑色素瘤效应,减缓或逆转肿瘤细胞的EMT进程,抑制肿瘤转移,这一研究结果将可能为黑色素瘤的免疫治疗开辟新的视角。