研究目的肝细胞癌（HCC）是恶性程度极高的消化系统肿瘤,目前的治疗效果有限。虽然已有不少研究报道了长链非编码RNA（lncRNA）在肝癌中的具体作用,但相对于可编码蛋白的RNA,lncRNA的研究仍需进一步加强。因此,本研究旨在探索新的参与调控肝癌发生发展的lncRNA,并阐明其具体的调控方式,为肝癌的诊治提供新的分子标记物和治疗靶标,扩展治疗方向和策略,以期实现对肝癌的早期诊断与早期治疗,提高患者生存率。同时,也为lncRNA在恶性肿瘤中发挥的重要功能提供新的证据。研究方法通过分析TCGA中的肝癌组织转录组测序数据,筛选出在肝癌中差异表达,以及与预后相关的长链非编码RNA FTO内含子转录本1（FTO-IT1）。收集武汉协和医院肝细胞癌患者的手术标本,比较32组肝细胞癌组织（HCC）及配对的癌旁组织（NT）中的FTO-IT1水平。将患者FTO-IT1表达水平分为高低两组,比较两组病例的生存时长。同时,比较正常肝细胞与肝癌细胞中FTO-IT1的表达水平。明确FTO-IT1在肝癌细胞系中的亚细胞定位。在FTO-IT1高表达的肝癌细胞系中转染小干扰RNA（siRNAs）以敲减FTO-IT1表达,进行MTT增殖实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验,观察FTO-IT1表达水平下调后对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。慢病毒包装FTO-IT1的siRNA并转染至MHCC97H细胞,构建稳定敲减FTO-IT1的细胞株。再利用此细胞进行皮下瘤种植,构建裸鼠异种移植瘤模型,评估敲减FTO-IT1对肝癌细胞的体内增殖的影响。向FTO-IT1低表达的肝癌细胞系中转染过表达FTO-IT1质粒,进行MTT增殖实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验,观察FTO-IT1表达水平上调后对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。将FTO作为FTO-IT1的潜在下游分子。比较TCGA数据和细胞中FTO的表达水平差异。免疫组织化学染色肝癌组织,比较FTO蛋白表达水平。采用斯皮尔曼相关性分析肝癌中FTO-IT1与FTO的表达相关性。向两个肝癌细胞系Hep G2和MHCC97H中转染了FTO-IT1的siRNAs,同时向Huh7细胞中转染了FTO-IT1的过表达质粒,通过q RT-PCR与Western Blot实验,观察FTO-IT1对FTO的m RNA和蛋白水平的调控作用。然后进行回复实验,共转染FTO-IT1 siRNAs和FTO的过表达质粒,同时共转染FTO-IT1过表达质粒和FTO siRNAs,检测FTO的m RNA和蛋白水平。进一步,以共转染细胞进行MTT细胞增殖实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验,评估FTO-IT1/FTO调控轴对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响。使用生物素标记的FTO-IT1进行RNA下拉实验,并联合液相色谱-串联质谱蛋白鉴定,寻找肝癌细胞中与FTO-IT1相互作用的蛋白质。分析质谱结果后,选中RNA结合蛋白ILF3作为FTO-IT1调控FTO表达的中间蛋白质分子。对下拉总蛋白质进行了Western blot,检测ILF3蛋白的存在。通过RNA和蛋白结合倾向评估工具cat RAPID,预测FTO-IT1与ILF3蛋白的结合能力。使用抗ILF3抗体进行RNA免疫共沉淀实验。q RT-PCR检测抗体富集的FTO-IT1表达水平。在Hep G2和MHCC97H细胞中敲减ILF3,同时在Huh7细胞系中过表达ILF3,观察改变ILF3水平后FTO表达水平的变化。进行序列比对结合ARE在线数据库AREsite2中的数据,探明FTO m RNA的3’UTR区的AU富集元件。进行RNA免疫共沉淀实验,q RT-PCR检测抗体富集的FTO m RNA表达水平。在肝癌细胞系中敲减或过表达ILF3进行RNA稳定性实验,检测FTO的m RNA稳定性。然后,敲减或过表达FTO-IT1后检测FTO的m RNA稳定性。同时,共转染FTO-IT1 siRNAs和ILF3过表达质粒,共转染FTO-IT1过表达质粒和ILF3 siRNAs,进行FTO的m RNA稳定性、m RNA与蛋白表达水平的检测。转染c-Myc的siRNAs以及过表达质粒,检测了FTO-IT1的表达情况。进行Ch IP实验,检测抗c-Myc抗体富集的DNA序列,探究c-Myc对FTO-IT1的转录调控作用。研究结果LncRNA FTO-IT1在肝癌组织和细胞中高表达,且其高表达与肝细胞癌患者的不良预后相关。敲减FTO-IT1后肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力下调,同时会抑制肝癌细胞的体内增殖,而过表达FTO-IT1可以促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。FTO在肝癌组织和细胞中同样表达上调,且与FTO-IT1的表达在肝癌中呈正相关。FTO-IT1的敲减降低了FTO m RNA和蛋白的表达水平,而过表达则增加了FTO m RNA和蛋白的表达水平。回复实验验证了FTO-IT1对FTO表达水平调控具有特异性。过表达FTO回复了敲减FTO-IT1后引起的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的下降,而敲减FTO后逆转了过表达FTO-IT1对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用。蛋白质谱和Western blot检测显示FTO-IT1可以与RNA结合蛋白结合ILF3相结合。抗ILF3抗体同样可以显著富集FTO-IT1转录本。此外,抗ILF3抗体还可明显富集FTO m RNA。敲减ILF3后下调FTO的m RNA和蛋白水平,以及其m RNA稳定性;过表达ILF3后则可上调FTO的m RNA和蛋白水平,以及其m RNA稳定性。回复实验显示,过表达ILF3回复了敲减FTO-IT1后FTO m RNA和蛋白水平的下调,以及m RNA稳定性的削弱,而敲减ILF3后逆转了过表达FTO-IT1后FTO m RNA和蛋白水平的上调,以及m RNA稳定性的增强。敲减c-Myc后FTO-IT1的表达下调,过表达c-Myc后FTO-IT1的表达上调。cMyc可以在转录水平激活FTO-IT1的表达。研究结论LncRNA FTO-IT1在肝癌组织及细胞中高表达,其高表达与肝细胞癌患者的不良预后相关。FTO-IT1在m RNA及蛋白水平上调控FTO的表达,并通过调控FTO的表达发挥其在肝癌中的促癌作用,具体机制是:FTO-IT1结合ILF3蛋白,将ILF3招募至FTO m RNA的3’UTR,提高FTO m RNA的稳定性,最终促进FTO的表达。此外,c-Myc可以转录激活FTO-IT1的表达。总之,本研究揭示了lncRNA FTO-IT1通过FTO促进肝癌进展的调控机制,为FTO-IT1作为肝癌潜在的诊断治疗靶点提供了有限但可靠的理论依据,并为lncRNA在恶性肿瘤中的重要作用提供了新的证据。