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糖皮质激素（Glucocorticoids,GCs）常常被用作临床上治疗某些炎症性疾病和自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、肾病综合征等的一种药物,但部分患者长期接受激素治疗后会发生股骨头坏死（Osteonecrosis of the femoral head,ONFH）,出现髋关节疼痛、关节活动受限和负重行走功能障碍等表现。激素性股骨头坏死（Steroid induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH）的病程进展很难通过药物治疗逆转,部分患者最终需要进行全髋关节置换（total hip arthroplasty,THA）手术治疗。虽然对此病的病因及发病机制学者们已有较多研究,但迄今为止此病的发生仍不能用单一的病理机制来解释。很多学说解释了激素性股骨头坏死在病理生理上的发病机制。细胞凋亡假说是目前研究较多的方向。研究者指出激素对骨细胞与成骨细胞的促凋亡作用是直接的,引起的缺血性改变是间接的。还有研究者认为激素引起的是骨细胞和成骨细胞的凋亡而非细胞死亡。因此,激素引起的骨细胞和成骨细胞凋亡是股骨头坏死发生的重要机制。糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β）,是一种细胞生理活动的关键调节剂,包括糖代谢、细胞周期、信号转导、基因转录、翻译、细胞增殖、细胞生存与死亡等方面。GSK3β既可通过Wnt/β-catenin调控细胞分化与增殖,还可介导各种细胞（包括成骨细胞）的细胞凋亡过程。GSK3β介导凋亡的机制可能与p53、Bax、ERK相关,也可能与线粒体亲环素D（Cyclophilin D,Cy P-D）、腺嘌呤核苷酸转位酶（Adeninenueleotidetranslocase,ANT）以及线粒体膜通透转换孔（Mitochondrial permeability transition pore,m PTP）相关。也有文献报道GSK3β可介导激素引起的成骨细胞凋亡。但是,GSK3β介导的成骨细胞凋亡能否在激素性股骨头坏死中起作用,GSK3β是如何介导成骨细胞凋亡的,其机制尚不清楚。在本研究中,我们建立了大鼠激素性股骨头坏死模型,了解GSK3β介导的成骨细胞凋亡能否在激素性股骨头坏死中起作用。通过地塞米松（Dexamethasone,Dex）诱导成骨细胞凋亡模型,探讨GSK3β在地塞米松诱导成骨细胞凋亡中的机制。通过shRNA基因沉默及基因芯片技术,筛选与GSK3β介导细胞凋亡相关的基因和信号通路。对筛选到的机械敏感性阳离子通道Piezo2进行进一步研究,了解它在激素引起成骨细胞凋亡和以及成骨细胞OPG、RANKL表达的影响。第一部分GSK3β介导的成骨细胞凋亡参与了大鼠激素性股骨头坏死目的:研究GSK3β在大鼠激素性股骨头坏死中的作用及机制。方法:构建大鼠激素性股骨头坏死模型,同时给予Li Cl（GSK3β抑制剂）灌胃,通过H&E染色观察股骨头空骨陷窝的发生率,通过TUNEL染色检测股骨头细胞凋亡发生的情况,通过micro-CT评价股骨头骺板下松质骨的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间隙（Tb.Sp）。此外,我们通过Western Blot法检测股骨头组织p-Ser-9 GSK3β、总GSK3β、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果:激素性股骨头坏死模型组空骨陷窝率和TUNEL阳性细胞率明显升高,LiCl处理明显改善了这些状况。模型组出现了骨质疏松,表现为BV/TV下降,Tb.N减少,Tb.Th下降,Tb.Sp增加,LiCl处理增加了骨量。模型组p-Ser-9 GSK3β和Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加,Li Cl灌胃逆转了这些改变。结论:GSK3β介导的成骨细胞凋亡参与了激素引起的大鼠股骨头坏死。第二部分GSK3β通过线粒体途径介导地塞米松引起的成骨细胞凋亡目的:探讨GSK3β在地塞米松诱导成骨细胞凋亡中的机制。方法:地塞米松处理大鼠原代成骨细胞后,分别采用MTT试验与Annexin V/PI双染流式细胞仪法检测细胞活力与细胞凋亡。然后,我们用GSK3β-siRNA敲减成骨细胞GSK3β的表达,用q RT-PCR法检测GSK3βmRNA,用Western Blot法检测蛋白表达的水平,我们用TUNEL染色及Annexin V/PI双染法检测地塞米松及GSK3β-siRNA处理后的大鼠原代成骨细胞的凋亡水平,用JC-1荧光试剂盒检测线粒体膜电位水平。此外,我们用Western Blot法检测caspase-9、caspase-3、PARP、及细胞色素C的表达水平。结果:地塞米松呈剂量依赖性抑制了大鼠原代成骨细胞增殖和促进成骨细胞凋亡。GSK3β-siRNA转染减少了成骨细胞GSK3βmRNA的表达,地塞米松处理减少了p-Ser-9 GSK3β的表达,GSK3β-siRNA转染同时减少了总GSK3β和p-Ser-9 GSK3β的蛋白表达。地塞米松处理增加了大鼠原代成骨细胞的TUNEL阳性细胞率,降低了线粒体膜电位,GSK3β-siRNA处理抑制了这些效果。地塞米松处理增加了细胞cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,PARP的表达水平,促进了细胞色素C从线粒体内向线粒体外释放,GSK3β-siRNA处理抑制了这些效应。结论:GSK3β可通过线粒体途径介导地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。第三部分GSK3β-shRNA对地塞米松处理的成骨细胞基因表达谱的影响目的:通过基因芯片技术研究GSK3β在地塞米松引起MC3T3-E1成骨细胞凋亡中的机制。方法:构建转染GSK3β-shRNA的MC3T3-E1成骨细胞稳转株。用地塞米松处理细胞,将细胞分为对照组,地塞米松组,地塞米松+GSK3β-shRNA组,用流式细胞仪检测凋亡,同时进行cDNA芯片杂交和数据分析。对感兴趣基因的基因表达进行q RT-PCR验证。结果:成功构建了转染GSK3β-shRNA的MC3T3-E1成骨细胞稳转株。流式细胞仪检测表明地塞米松增加了成骨细胞凋亡,GSK3β-shRNA处理减少了细胞凋亡。基因芯片结果显示Piezo2、Hoxb8、Kif18a、Dlk1、Tnfsf14、Casq2、Bcl2l14等基因以及凋亡通路、MAPK通路、TGFβ通路和WNT通路等信号通路可能参与了GSK3β介导的地塞米松诱导成骨细胞凋亡过程。结论:GSK3β-shRNA影响了地塞米松处理下成骨细胞的基因表达谱和各种信号通路。Piezo2、Hoxb8、Kif18a、Dlk1、Tnfsf14、Casq2、Bcl2l14等基因可能与GSK3β介导的地塞米松诱导成骨细胞凋亡相关。第四部分机械敏感性阳离子通道Piezo2在地塞米松引起成骨细胞凋亡中的作用及对成骨细胞OPG、RANKL表达的影响目的:研究机械敏感性阳离子通道Piezo2在地塞米松引起成骨细胞凋亡中的作用及对成骨细胞OPG、RANKL表达的影响。方法:用Western Blot法检测地塞米松及GSK3β-shRNA对MC3T3-E1成骨细胞Piezo2蛋白表达的影响。用Piezo2-siRNA敲减MC3T3-E1成骨细胞中Piezo2 mRNA的表达,检测Piezo2-siRNA对成骨细胞OPG、RANKL蛋白表达的影响。用流式细胞仪及TUNEL染色的方法检测Piezo2-siRNA对MC3T3-E1成骨细胞凋亡的影响,并检测Piezo2-siRNA与地塞米松联合应用时对MC3T3-E1成骨细胞凋亡的影响。结果:Piezo2蛋白在地塞米松处理后表达减少,在GSK3β-shRNA处理后表达增加。Piezo2-siRNA增加了MC3T3-E1成骨细胞OPG的表达,减少了RANKL的表达。Piezo2-siRNA既降低了正常MC3T3-E1成骨细胞的凋亡率,也降低了地塞米松处理的MC3T3-E1成骨细胞的凋亡率。结论:机械敏感性阳离子通道Piezo2能改变MC3T3-E1成骨细胞的OPG与RANKL的表达,并能在地塞米松引起的成骨细胞凋亡中起作用。