研究背景:肺癌（lung cancer）是全球范围内发病率最高的恶性异质性肿瘤之一,每年可造成数以万计的人死亡。尽管在过去十年来,肺癌的治疗手段飞速发展、治疗方式日新月异,但患者的预后依然不尽如人意。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最常见的病理组织类型,约占肺癌的85%。目前,临床上针对不可手术的局部晚期或晚期NSCLC的治疗方法主要是采用放疗、化疗、靶向治疗及免疫治疗等,其中放射治疗依然是最为常规且有效的局部治疗手段,在NSCLC的治疗中起着重要作用。然而,对于恶性程度相似且放疗方案相同的病人,放疗的疗效仍然是千差万别。此外,即使是病人在治疗后达到了临床完全缓解（clinical complete response,c CR）,部分患者在后期仍会出现肿瘤复发和转移。肿瘤对电离辐射（ionizing radiation,IR）耐受导致的放疗抵抗可能是造成上述临床结局和患者预后不良的重要原因。因此,阐明NSCLC放疗抵抗的具体机制,寻找有效的放疗增敏的新靶点有助于改善临床上NSCLC患者放疗抵抗的现象。纺锤体蛋白SPIN1（Spindlin1）是SPIN1/SSTY蛋白家族一员,最先以其在卵母细胞发育过程中发挥了重要作用而为人所熟知。近年来有研究结果发现SPIN1在多种人类恶性肿瘤组织如卵巢癌、乳腺癌、胃癌及脂肪肉瘤中高表达,异常表达的SPIN1能够导致细胞周期紊乱,影响基因组稳定性,促使细胞发生恶性转化。本课题组成员先前研究发现了SPIN1可以通过负性调控p53信号通路,从而促进肿瘤细胞增殖和恶性进展。以上结果提示SPIN1可能是参与恶性肿瘤发生和发展的重要癌基因,但是SPIN1在NSCLC中异常表达的机制尚不完全明确。目前国内外文献主要探讨了SPIN1的上游调控机制在肺癌发生进展中的作用,而对于SPIN1转录激活的下游具体分子机制尚不清楚,此外,SPIN1在NSCLC放疗抵抗中的生物学功能也未见相关研究报道。本研究旨在从细胞学水平,裸鼠动物模型及临床样本三个层面进行探索和验证,借助生物信息学分析、分子生物学实验和高通量测序技术等多手段探讨SPIN1在NSCLC中的临床意义及其在NSCLC放射抗性中的具体分子机制,揭示SPIN1在诱导NSCLC细胞放疗抵抗中的重要作用,有望为NSCLC患者放疗增敏提供新方向。第一部分:SPIN1在NSCLC中的作用研究目的:探索SPIN1在NSCLC组织和细胞中的表达情况及其对人NSCLC细胞生物学行为的影响。方法:1、为了明确SPIN1在NSCLC中的具体作用,本课题组首先借助公共数据库Oncomine分析SPIN1在不同组织学类型的肺癌组织及正常组织中m RNA水平的表达情况。采用免疫组化及Western blotting检测SPIN1在NSCLC组织标本、毗邻的正常肺组织标本以及NSCLC细胞系和正常肺上皮细胞中的表达水平差异,并进一步分析SPIN1表达水平与NSCLC患者临床病理参数及患者预后的相关性。2、为了明确SPIN1在NSCLC中的生物学功能,我们通过siRNA技术靶向下调SPIN1的表达后,采用细胞学实验CCK-8实验、EDU细胞增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验以及Transwell实验体外探讨SPIN1对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。3、为了进一步验证SPIN1在NSCLC增殖过程中所发挥的作用,我们课题组利用慢病毒感染技术构建稳定干扰SPIN1表达的细胞株后（A549-scramble sh RNA和A549-SPIN1 sh RNA）,通过构建肿瘤裸鼠皮下移植成瘤模型体内验证SPIN1对NSCLC细胞增殖能力的影响,从而初步判定其作为NSCLC治疗靶点的可行性。结果:1、Oncomine数据库分析显示,与正常的肺上皮组织相比,NSCLC组织中的SPIN1m RNA水平均明显升高。免疫组化实验结果显示SPIN1主要位于NSCLC细胞核中,在86/120（71.1%）的NSCLC组织中观察到SPIN1高表达,而在42/120（40%）的配对正常组织中观察到其高表达。临床病理参数分析揭示组织水平上SPIN1的高表达与肿瘤的大小（p=0.021）、淋巴结转移（p=0.023）、T分期（p=0.014）和TNM分期（p=0.006）显著相关。此外,Kaplan-Meier结果表明高表达SPIN1的NSCLC患者的总体生存率比低表达的患者低（p＜0.05）,提示SPIN1的高表达与NSCLC患者预后不良密切相关。Western blotting进一步检测NSCLC组织和细胞系中的SPIN1的蛋白表达水平,得到了类似的结果,NSCLC组织和细胞系中的SPIN1表达水平明显高于正常的非肿瘤组织及正常肺上皮细胞。其中,NSCLC细胞A549和HCC827因其高水平的SPIN1含量被选为我们进一步的实验对象。2、干扰NSCLC细胞株A549和HCC827中SPIN1的表达后,CCK-8、EDU细胞增殖实验以及平板克隆形成实验结果显示NSCLC细胞的增殖活性以及克隆形成的能力受到了抑制;划痕实验、Transwell实验进一步显示NSCLC细胞的迁移和侵袭能力在沉默SPIN1的表达后也受到了抑制。3、体内裸鼠移植瘤模型结果显示,沉默SPIN1可使得移植瘤较正常对照组生长减慢、体积减小以及瘤体重量减轻,提示在动物水平上干扰SPIN1能显著抑制裸鼠移植瘤的生长,进一步证实SPIN1具有促进NSCLC细胞体内增殖的能力。结论:SPIN1在NSCLC患者中显著高表达,与患者不良预后密切相关。SPIN1在NSCLC细胞中发挥类似“癌基因”的作用,能促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭。第二部分:SPIN1与NSCLC细胞的放射敏感性的相关性研究目的:检测沉默SPIN1对NSCLC细胞放疗敏感性的影响。方法:1、为了进一步明确SPIN1对NSCLC细胞的放疗敏感性的影响,我们在体外细胞水平上,联合不同剂量的射线（0、2、4、6、8Gy）照射NSCLC细胞后,采用细胞克隆形成实验检测不同剂量放疗后A549和HCC827细胞中的克隆形成能力,计算各照射剂量下细胞的存活分数,利用单击多靶模型拟合绘制剂量存活曲线,对比分析沉默SPIN1对NSCLC细胞的放射敏感性的影响。2、细胞周期再分布是放疗抵抗产生的重要机制,为了明确SPIN1对放疗后细胞周期分布的影响,我们首先对转染了SPIN1 siRNA或SPIN1 si-NC 48h细胞株A549和HCC827进行分组（si-NC组、si-NC+放疗组、SPIN1-siRNA#1+放疗组以及SPIN1-siRNA#2+放疗组）,以6Gy IR照射对应的放疗组细胞,静置处理6h后收集各组细胞用于后续实验。应用流式细胞术检测SPIN1对放疗诱导的各组细胞的细胞周期重分布的影响,观察干扰SPIN1后射线照射下的NSCLC细胞细胞周期的影响。3、除了调节细胞周期再分布,DNA损伤应答反应（DNA damage response,DDR）增强也是放疗抵抗的另一重要原因。为了进一步明确SPIN1与电离射线导致的NSCLC细胞DNA损伤和修复的相关性,我们通过采用中性彗星实验探究IR是否可以在下调SPIN1的表达后诱导NSCLC细胞产生更多的DNA损伤。与此同时,我们进一步运用免疫荧光实验对DNA损伤标志物γ-H2AX进行直接分析以检测干扰SPIN1对接受了放疗的NSCLC细胞中γ-H2AX小体形成的影响。4、为了进一步探讨SPIN1在体内调节NSCLC细胞放疗敏感性的作用。我们通过对A549进行慢病毒转染,稳定干扰SPIN1的表达后建立裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为SPIN1-LVsh-scramble空载组、SPIN1-LVsh-scramble空载+IR组和SPIN1-LVsh RNA#1+放疗组。在裸鼠种植肿瘤细胞后的第7天,我们开始对放疗组的裸鼠给予连续5天、每天2Gy剂量的射线进行瘤体照射,共计10Gy。观察并记录移植瘤的生长情况,以期在动物水平上探讨SPIN1的表达对NSCLC细胞放射敏感性的影响。结果:1、体外细胞株细胞克隆形成实验的结果均表明,随着IR剂量的提高,SPIN1沉默放疗组较于空载放疗组的NSCLC细胞形成的克隆数目少、克隆存活分数下降（p＜0.05）,提示干扰SPIN1可以显著增加NSCLC细胞对于IR的敏感性。2、流式细胞术分析结果显示干扰SPIN1表达后,放疗引起的G2/M期阻滞减弱,提示SPIN1沉默后,NSCLC细胞对放疗的敏感性显著增加。3、中性彗星实验结果证实干扰SPIN1的表达会增加放疗导致的DNA损伤尾距,DNA双链断裂（DSB）增加;此外,免疫荧光结果显示,与正常放疗组对比,放疗组中沉默SPIN1的NSCLC细胞内γ-H2AX小体焦点数目显著增加（p＜0.05）。因此,SPIN1可以通过减少DNA损伤,增强DNA修复促进NSCLC细胞放疗抵抗。4、体内裸鼠荷瘤实验结果显示放疗组的肿瘤生长速度明显低于未放疗组,提示放疗能够有效减小肿瘤大小,而值得一提的是,与SPIN1-LVsh-scramble空载放疗组相比,SPIN1-LVsh RNA#1沉默放疗组的裸鼠移植瘤的瘤体明显更小、重量更轻且生长速度更慢,进一步表明沉默SPIN1可以增强NSCLC细胞对放疗的敏感性。结论:SPIN1可以引起G2/M期阻滞,增强DNA损伤修复,诱导NSCLC细胞发生放疗抵抗,而沉默SPIN1可提高NSCLC细胞的放疗敏感性。以上研究提示SPIN1可能是NSCLC放疗增敏的重要潜在靶标。第三部分:SPIN1调控NSCLC细胞放疗抵抗的作用机制研究目的:探究SPIN1调控NSCLC细胞放射敏感性的具体作用机制。方法:1、为了进一步阐明SPIN1调控NSCLC放射敏感性的具体作用机制,本课题组干扰NSCLC细胞A549的SPIN1后,运用高通量转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）技术筛选潜在可能受SPIN1调控的差异表达基因。根据差异基因的变化倍数（fold change）和p值的大小,并结合既往文献报道参与放疗抵抗的情况,采用实时定量PCR（q RT-PCR）实验进一步验证在NSCLC细胞中干扰SPIN1的表达后候选基因的表达情况。2、通过筛选,本项目组选定FOXM1作为靶标并进行了深入分析。为了进一步探索FOXM1在SPIN1介导的NSCLC细胞放疗抵抗的潜在作用,我们对测序结果采取了进一步的深层分析,以期探讨FOXM1及其下游靶分子CCND1、BRCA2和RAD51（与DNA修复密切相关）的表达水平。同时,再次在NSCLC细胞中采用q RT-PCR技术进一步验证上述分子的表达情况。RAD51焦点形成实验用于进一步检测SPIN1对IR照射后NSCLC细胞DNA修复的标志物RAD51的影响。3、为了理解SPIN1和FOXM1相互作用的分子机制,我们首先根据文献追踪结果推测FOXO3a-FOXM1通路可能参与NSCLC细胞的放疗抵抗。既往其他研究的研究证实SPIN1可以通过与MDM2的H3K4me3位点结合增强其对底物的泛素化降解作用,而FOXO3a被报道为MDM2的底物之一。为进一步研究SPIN1如何调控FOXO3a的蛋白表达,我们首先采用Western blotting检测SPIN1沉默后NSCLC细胞中FOXM1、FOXO3a、MDM2以及RAD51的蛋白水平,随后运用了CHX（cycloheximide,放线菌酮）追踪实验检测调控SPIN1的表达对FOXO3a蛋白半衰期的影响,蛋白酶体抑制剂MG132和体内泛素化实验观察验证SPIN1对FOXO3a的调控作用是否依赖于MDM2介导的蛋白酶体降解途径。4、为了进一步探究SPIN1在NSCLC细胞中的生物学作用是否确实依赖于转录因子FOXM1,我们首先在A549和HCC827细胞中分别靶向干扰SPIN1、FOXM1或同时干扰SPIN1和FOXM1,采用CCK-8、EDU细胞增殖实验和平板克隆形成实验对比验证下调SPIN1是否会影响沉默FOXM1的NSCLC细胞的增殖能力。此外,中性彗星实验、RAD51焦点小体形成实验以及克隆形成实验进一步验证FOXM1与SPIN1介导的NSCLC细胞放疗抵抗的关系。5、为了进一步证实FOXM1在SPIN1促NSCLC细胞放疗抵抗中的关键作用,我们将SPIN1的siRNA和FOXM1的过表达质粒进行了共转染,Western blotting检测了FOXM1及其下游靶基因的表达情况后,应用CCK-8、EDU细胞增殖实验和平板克隆形成实验证实过表达FOXM1对SPIN1沉默后的NSCLC细胞的增殖能力的影响。中性彗星实验、RAD51焦点小体形成实验以及克隆形成实验检测上调FOXM1后是否可以重新逆转SPIN1下调诱导的NSCLC细胞放疗增敏现象。结果:1、RNA-seq结果显示有1422个差异表达基因的fold change＞2,按照p值和fold change的排序情况,我们选择了前20个差异基因,其中PCSK9、SGPP1、PGK1和FOXM1以其与放疗抗性的相关性被划入SPIN1下游候选基因。q RT-PCR结果显示NSCLC细胞中下调SPIN1后,下游候选基因中FOXM1下调效果最明显,提示FOXM1可能为受SPIN1调控的重要下游分子。2、测序结果和q RT-PCR结果均证实敲低SPIN1后,FOXM1及其下游靶基因CCND1、RAD51和BRCA2的表达均显著下调。免疫荧光实验结果显示沉默SPIN1后放疗导致的RAD51小体减少,提示SPIN1通过调控FOXM1的表达可以影响DNA损伤修复从而调节NSCLC细胞的放疗抗性。3、Western blotting实验结果提示SPIN1与RAD51、FOXM1和MDM2呈现正相关,与FOXO3a呈现负相关。CHX实验证实SPIN1的表达影响FOXO3a蛋白的半衰期,干扰SPIN1的表达能显著延长FOXO3a蛋白的半衰期,反之可以缩短其半衰期;MG132实验证实SPIN1对FOXO3a的这种调节作用依赖于蛋白酶体途径;此外,体内泛素化实验进一步证实过表达SPIN1对FOXO3a的降解抑制作用是依赖于MDM2介导的FOXO3a的泛素化降解作用。4、CCK-8、EDU细胞增殖实验和平板克隆形成实验结果显示SPIN1或FOXM1的沉默均显著抑制了NSCLC细胞的增殖活性,但同时下调FOXM1和SPIN1相较于单独下调FOXM1并不能进一步抑制细胞的增殖能力,提示FOXM1是SPIN1主要的下游效应分子。此外,中性彗星实验、RAD51焦点小体形成实验以及克隆形成实验显示SPIN1介导的NSCLC放疗抵抗依赖于FOXM1。5、Western blotting实验证实FOXM1的过表达可以部分恢复SPIN1下调导致的FOXM1下游相关基因表达下降。CCK-8、EDU细胞增殖实验和平板克隆形成实验结果显示FOXM1过表达后可以恢复干扰SPIN1引起的NSCLC细胞增殖速度减慢。此外,中性彗星实验、RAD51焦点小体形成实验以及克隆形成实验显示FOXM1的上调可以显著逆转SPIN1下调导致的放射敏感性升高现象。因此,FOXM1是SPIN1在NSCLC细胞中发挥的放疗抵抗作用不可或缺的重要因素。结论:SPIN1可以通过促进MDM2对FOXO3a的泛素化降解作用,从而减轻FOXO3a对FOXM1的抑制作用,FOXM1的转录激活增强了细胞DNA的修复,最终导致NSCLC细胞具有放疗抗性。