E2蛋白是猪瘟病毒的跨膜结构糖蛋白,是最易发生变异的一种蛋白,能诱导感染动物产生保护性免疫和猪瘟病毒中和抗体,是一种免疫优势蛋白,其中A1、B、C区对介导中和抗体的产生很重要,用A1和B或A1和C的单抗可见协同中和反应。表达CSFV Brescia株E2蛋白重组伪狂犬病毒以及用亲和层析法从昆虫细胞中的基因工程E2蛋白均能保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染,可以确定E2蛋白诱导的免疫反应足以保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染。为制备猪瘟病毒E2蛋白的抗体,研究E2基因表达产物在免疫检测中的应用及E2蛋白的中和性抗原表位,我们进行了猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达。首先根据GenBank中登录的猪瘟病毒基因组序列,设计一对引物,利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术从本实验室保存的重组质粒(PGEX-4T-1-PE2)中扩增出大小约为622bp的基因;经单酶切鉴定,与已知的猪瘟病毒E2基因含有相同的DraⅠ酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pMD18-T载体,并转化宿主菌DH5α,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆PMD18-T-TE2,结果表明本实验成功的克隆到猪瘟病毒TE2基因。其次,根据所克隆的猪瘟病毒TE2基因序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆酶切位点设计另一对引物,应用PCR技术从重组质粒PMD18-T-TE2中扩增出长约622bp的猪瘟病毒TE2基因,编码包括CSFV E2囊膜糖蛋白主要抗原区域A、B、C和D。再将扩增的猪瘟病毒TE2基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中,经质粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建原核表达重组质粒PGEX-4T-1-TE2。然后将该重组质粒转化大肠杆菌(EcoliRosetta(DE3)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与TE2的融合蛋白GST-TE2,融合蛋白的分子量约为47.0KD,与预期结果相符。通过优化原核表达条件,确定了原核表达的最佳诱导时间和诱导剂浓度。对表达蛋白的可溶性进行鉴定,结果表明表达产物GST-TE2融合蛋白以包涵体形式存在。我们用优化的原核表达条件对含有PGEX-4T-1-TE2质粒的Rosetta(DE3)BL21菌进行大量诱导表达,反复冻融和超声方法裂解诱导菌,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,Folin-酚法测定提取的融合蛋白GST-TE2浓度约为1.2mg/ml。应用提取的GST-TE2融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体。琼脂扩散实验表明制备的多抗具有良好的反应性,ELISA实验表明鼠多抗的有效稀释度可达1:25600,免疫印记(Western-blotting,WB)实验证实鼠抗猪瘟病毒GST-TE2多抗含有抗GST抗体和抗融合蛋白GST-TE2抗体。综上所述,本研究成功地克隆了猪瘟病毒TE2基因,成功构建了原核表达质粒PGEX-4T-1-TE2并进行了原核表达,提取了融合蛋白GST-TE2,并且制备了效价高、反应性强的鼠源抗猪瘟病毒GST-TE2多克隆抗体,这些为进一步研究猪瘟病毒E2蛋白免疫学功能及其应用提供了试验材料。