研究背景骨质疏松症是最常见的骨代谢疾病,已成为全球范围内的重大公共卫生问题之一,其表现为骨量减少、骨密度降低,骨组织微观结构的破坏,这些改变导致骨脆性增加,随之增加了骨折发生的风险。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最终的结果也是最严重的并发症,目前已成为中老年最常见的骨科疾病。骨质疏松不仅导致骨折发生风险增加,亦影响骨折固定的稳定性和愈合过程,表现为骨痂形成量减少、质量不佳,骨折愈合延迟,骨折愈合生物力学性能下降等。因此,考虑到骨质疏松性骨折受损的骨愈合能力,在治疗上有必要使用促进骨折愈合的药物和方法。在以往的研究中证实了骨形态发生蛋白(BMPs)在骨质疏松症中与骨代谢和病理中的关系。Urist在发现BMPs20年后,把骨质疏松症症描述为骨形态发生蛋白自身免疫性疾病,这导致科学界开始关注BMPs是否参与了骨质疏松症的病理过程,并把BMPs作为治疗靶点进行研究。有学者认为可以通过操控BMPs和它们拮抗剂中间的平衡关系(作为成骨细胞、破骨细胞生成和骨重建比率的决定性因素)来引入一种全新的骨代谢疾病治疗方式。有研究指出在骨质疏松症状态下,骨组织内BMPs含量的降低,致使骨生成减少。因此应用BMPs直接促进骨折愈合是未来骨组织修复的方向之一。自从骨形态发生蛋白2(BMP-2)被发现、纯化、基因克隆以来,重组骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)对整个骨科都产生了巨大的影响。美国食品药品监督管理局已批准在骨折处局部应用rhBMP-2促进胫骨骨折的愈合,以减少延迟愈合和不愈合的发生率。考虑到骨质疏松性骨折中BMP-2水平下降和表达延迟。现已有多个实验研究在骨折局部应用BMP-2以促进和改善骨质疏松骨折的愈合,并取得较为满意的效果。对骨质疏松性骨折局部应用BMP-2的优势包括:操作方便,局部给药对全身干扰少,作用部位精准,可快速增加骨折局部的骨量和促进骨折愈合。但目前rhBMP-2生物利用率低,载体释放曲线不理想,导致局部需要大剂量应用,这也产生了一系列的并发症。为了能取得最满意的成骨效果同时避免并发症,除了改善释放载体以获得更好的rhBMP-2释放曲线,目前越来越多的学者将目光投向联合用药,将局部rhBMP-2应用和使用全身药物联合协同起来提高BMP-2的利用效率,以减少在局部外源性rhBMP-2的使用剂量。对于骨质疏松性骨折rhBMP-2联合全身抗骨质疏松药物使用,既可以加速骨折的修复,又可以抗骨质疏松治疗似乎是骨质疏松性骨折治疗最理想的选择。目前在临床应用的一线抗骨质疏松治疗和干预骨质疏松性骨折的药物,例如:二膦酸盐类、狄诺塞麦和雌激素代替治疗的主要机制是通过抑制破骨细胞,以减少骨吸收和降低骨转换,其治疗目标为预防骨质疏松性骨折的再发生。但这些抗骨质疏松药物对骨质疏松性骨折愈合的影响尚不完全明确,对骨质疏松性骨折愈合的作用也仍存争议。骨质疏松性骨折多发于中老年患者,这类人群骨折延迟愈合较为常见,有高达1/3的股骨干和胫骨骨折可能发生延迟愈合。因此,新一代的改善骨质疏松性骨折愈合治药物的目标,已不仅仅是单纯的抑制骨吸收,而是同时能刺激成骨细胞的活性,加速骨形成。在我国传统医学中,肾主骨是最重要的理论之一,肾虚被认为是所有骨组织疾病的根源、包括:骨与关节损伤、退变和骨质疏松症等。传统中医对肾的理解是全身内分泌功能的总称,这与现代医学肾脏对钙磷代谢调控功能所发挥内分泌的功能是一致的,因此骨组织的质量与肾功能密切相关。正是基于肾主骨的理论,千百年来补肾中药常用于治疗骨折和关节损伤等疾病。补骨脂味辛、苦,性温,归肾脾二经,是最常用的补肾中药之一,也是中医临床上治疗骨质疏松症和骨伤疾患的常用药。补骨脂素是补骨脂主要有效活性成分,属于呋喃香豆素类的植物雌激素。以往研究提示补骨脂素可促进骨髓间充质干细胞的增殖,诱导其向成骨细胞分化,也能增加成骨细胞活性,刺激骨形成,并能抑制破骨细胞活性。我们的前期研究结果也证明补骨脂素灌胃治疗可改善骨质疏松动物模型的骨微观结构和生物力学性能。研究目的本实验通过建立骨质疏松小鼠骨折模型,观察补骨脂素联合rhBMP-2对骨质疏松小鼠骨折修复的影响。同时通过观察血清骨代谢生化指标和骨折对侧股骨远端组织学的变化,探讨补骨脂素联合rhBMP-2对去卵巢骨质疏松骨折期间骨质疏松的影响。研究方法与内容实验一:130只9周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠,适应性喂养3周后至12周龄到达性成熟。把130只C57BL/6J小鼠分为两组,其中去卵巢组125只,假手术组5只。去卵巢组,背侧切口行经腹双侧卵巢切除,而假手术组在暴露卵巢后仅切除卵巢周围少量脂肪组织。去卵巢术后6周,通过检测小鼠体重,雌激素水平,子宫湿重和子宫、股骨HE染色的方法确认骨质疏松模型的建立。实验二:在确认建立骨质疏松小鼠模型成功后,去卵巢组随机分为4组:模型组,补骨脂素组,rhBMP-2组和联合用药组,每组30只。制作小鼠股骨中段骨折模型,模型组行股骨中段骨折植入可吸收明胶海绵(ACS)+生理盐水灌胃,补骨脂素组行股骨中段骨折植入ACS+补骨脂素(20 mg/kg/d)溶液灌胃,rhBMP-2组行股骨中段骨折局部植入复合rhBMP2(2.5μg)的ACS+生理盐水灌胃,联合用药组行股骨中段骨折局部植入复合rhBMP2(2.5μg)的ACS+补骨脂素(20 mg/kg/d)溶液灌胃。通过钼靶X线、Micro-CT、组织学、荧光定量PCR和生物力学等检测方法,观察补骨脂素联合rhBMP-2对骨质疏松小鼠骨折修复的影响。实验三:分组和实验动物同实验二,在骨折术后3周检测各组小鼠血清骨代谢生化指标和雌激素水平,同时观察骨折对侧股骨远端组织学的变化,以研究补骨脂素联合rhBMP-2对去卵巢骨质疏松小鼠骨折期间骨质疏松的影响。研究结果实验一:小鼠去卵巢术后6周后,体重较假手术组明显增加(P<0.05),血清雌激素水平明显下降(P<0.05),子宫湿重明显减低(P<0.05);子宫HE染色切片的结果提示:与假手术比较,去卵巢组小鼠的子宫内膜管壁明显变薄,内膜腺体明显变少并腺体萎缩;以上结果说明小鼠去卵巢手术成功可靠。股骨远端HE染色切片显示:去卵巢组小鼠股骨的骨皮质变薄,骨小梁密度明显稀疏、间距变宽,髓腔宽大,同时出现无骨小梁的骨髓区,符合骨质疏松的表现。实验二:骨折术后10天的X线和组织学结果显示,与其他三组比较,联合用药组骨折两端骨痂生成更多,骨痂密度较高,骨痂内骨性骨痂明显增多,成骨细胞更加活跃。骨折术后21天X线和Micro-CT结果显示,联合用药组骨折较其它三组愈合更为充分,骨痂完全覆盖骨折断端,骨折线消失,骨折基本愈合。联合用药组的矿化骨痂体积(BV)、矿化骨痂百分比(BV/TV)和平均矿化密度(TMD)明显高于其他3组(P<0.05)。骨折21天组织学检测提示,其它3组仍可见较多软骨骨痂,联合治疗组骨痂区域充满大量的较成熟的骨痂、部分连接成片,骨痂已处于吸收塑性阶段。补骨脂素组和联合用药组骨痂中破骨细胞数量更稀少,但4组破骨细胞形态和细胞核数量未见明显差异。免疫组化结果显示,联合用药组和补骨脂素组的BMP-2阳性AO值明显高于模型组和rhBMP-2组(P<0.05)。补骨脂素、rhBMP-2组和联合用药组骨矿化沉积率(MAR)明显高于模型组。与模型组比较,补骨脂素和rhBMP-2组有显著性差异(P<0.05),联合用药组有极显著性差异(P<0.01)。联合用药组术后10天和21天Osteocalcin和Osterix基因表达水平都明显高于模型组。联合用药组拥有最佳的生物力学性能,弯曲弹性模量,最大载荷和最大应力都明显高于模型组(P<0.05)。实验三:术后21天血清学检查结果显示,与模型组比较,补骨脂素组、rhBMP-2组和联合用药组BALP水平都有不同程度升高,但只有联合治疗组有显著性差异(P<0.05);补骨脂素组和联合用药组血清CTX-I水平明显低于模型组和rhBMP-2组(P<0.05);模型组、补骨脂素组、rhBMP-2组和联合用药组血清雌激素水平比较无统计学差异(P>0.05)。股骨组织学观察显示4组骨组织形态中骨皮质差异并不十分明显,与模型组比较,rhBMP-2组在形态上无明显差异,补骨脂素组和联合用药组小鼠松质骨形态结构相对完整,骨小梁数量增多变致密且较均匀。补骨脂素组和联合用药组小鼠股骨远端干骺端的TRAP染色阳性的细胞的数量明显少于较模型组和rhBMP-2组(P<0.05)。研究结论1.使用12周龄C57BL/6J雌性小鼠,采用手术去卵巢去势6周,能较好的模拟绝经后女性因雌激素缺失对骨量丢失造成的影响,可作为制作骨质疏松动物模型的可靠方法。2.采用补骨脂素口服和rhBMP-2局部联合用药能到达在骨质疏松小鼠骨折局部早期BMP-2迅速靶向释放,刺激成骨细胞增殖、分化,同时补骨脂素通过持续口服给药,可在骨折愈合中晚期持续增加成骨细胞Osteocalcin、Osterix基因和骨折局部BMP-2的表达水平,协同增加成骨细胞活性,加速骨折修复,效果优于rhBMP-2和补骨脂素单独用药。补骨脂素能平衡破骨细胞功能,不影响骨痂重塑过程。这一结果表明,补骨脂素和rhBMP-2联合用药有可能减少单独局部rhBMP-2和全身补骨脂素的使用剂量,减少两者大剂量使用的副反应,提高临床效果和成本效益。3.补骨脂素作为一种天然植物雌激素,可能对雌激素受体选择性的发挥了作用,不明显增加体内雌激素水平,联合用药能调动骨折局部和全身成骨细胞活性,并能抑制破骨细胞在一定程度上减少骨吸收,改善骨质疏松症骨组织的微观结构。