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目的颈椎后纵韧带骨化症(OPLL)好发于65岁以上的东亚人群,其特点表现为后纵韧带的增生、肥厚和骨化,伴随着骨化的进展,可逐渐加重椎管狭窄以及脊髓和神经根受压的程度,进而出现不同程度的神经受损表现,严重影响生活质量。目前尚无疗效满意的保守疗法,如果症状严重,患者最终会选择手术治疗,但也存在一些问题,比如风险较高;易出现严重的并发症;手术疗效对于有些患者而言并不确切。因此目前的研究重点是探寻其发病机制。经过多年的研究,遗传、微环境、代谢、力学改变等学说被广为接受,但这些尚难以解释其完整的发病机理,需要更进一步探索。(1)近年来有研究显示,PERK介导的内质网应激(ERS)是人体内成骨作用、骨形成不可或缺的重要机制,且可在机械应力诱导牙周韧带细胞骨化过程中发挥调控作用,但对于颈椎后纵韧带骨化的影响尚无报道,需要我们去验证该现象在机械应力诱导OPLL过程中的作用机制。(2)在我们的既往研究中发现,OPLL患者后纵韧带细胞表达Cx43要明显高于非骨化患者,而且初步证实在颈椎后纵韧带骨化的过程中,Cx43可能发挥了重要的调控作用;目前研究发现Cx43可通过ERK调节成骨、软骨细胞代谢,且Src/MEK/ERK通路与OPLL发病机制密切相关,因此需要探讨Cx43是否可通过MAPK相关通路调控OPLL。(3)有文献报道在某些病理过程中,Cx43可通过ERS发挥相应的调节作用;且ERS可激活MAPK家族信号通路,进而调控细胞的各种生命活动。明确在应力刺激作用下,Cx43是否可通过PERK介导的ERS激活MAPK信号通路,进而调控骨化,有利于进一步认识OPLL的发病机制。方法自2015年12月至2017年6月,16名颈椎后纵韧带骨化和24名非骨化患者,均采取颈椎前路减压(经椎间隙或椎体次全切除)植骨融合内固定术,术中收取大块后纵韧带组织标本,尽量避免使用枪状咬骨钳嵌压韧带组织。采取酶消化法分离、培养韧带细胞,对细胞内波状蛋白进行免疫组化染色以鉴定后纵韧带细胞,并进行后续分子生物学研究。具体步骤为:(1)取第3代骨化和非骨化组韧带细胞,采用RT-PCR检测mRNA水平的表达,Western-blotting检测蛋白水平的表达,比较两组间PERK、CHOP、GRP78等ERS相关指标和ALP、OCN、COL I等成骨标志物的表达差异;采用Flexercell应力加载系统对非骨化组细胞施加应力刺激,比较刺激前后上述指标及流式细胞仪检测活性氧(ROS)水平的改变;用PERK通路特异性抑制剂抑制非骨化组细胞的ERS,再予以应力刺激,观察各项成骨标志物的表达变化。(2)利用免疫组化法比较骨化组和非骨化组韧带细胞内p38 MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相关指标的磷酸化水平,Western-blotting检测应力刺激对上述指标在非骨化组细胞内磷酸化程度的影响;制备Cx43的siRNA序列,采用慢病毒携带此序列转染细胞,分别从基因及蛋白表达水平检验其抑制效率,并进一步观察干扰Cx43对于机械应力激活MAPK通路的影响;依次干扰Cx43和特异性抑制p38 MAPK、ERK1/2、JNK各通路后,检测应力刺激下各项成骨标志物的基因表达。(3)干扰非骨化组细胞内的Cx43后予以应力刺激,检测PERK、CHOP、GRP78的表达以及ROS水平,再过表达Cx43,观察上述指标的变化;观察抑制PERK介导的ERS对于机械应力激活MAPK通路的影响;在机械应力加载模型的基础上,依次用siRNA/Cx43和PERK通路特异性激活剂处理非骨化患者的韧带细胞,检测MAPK相关指标的磷酸化程度和成骨标志物的表达。结果利用酶消化法培养第3代细胞生长状态良好,形态稳定,排列有序;主要以长梭形和多角形为主,胞体丰富,呈放射状、旋涡状生长。骨化组及非骨化组细胞形状无明显区别。对波形蛋白采取免疫组化染色呈阳性,证实了其成纤维细胞性质。(1)通过检测PERK、CHOP、GRP78等ERS相关指标和ALP、OCN、COL I等成骨标志物在mRNA和蛋白水平的表达,发现骨化组均明显高于非骨化组,差异显著(p<0.05);对非骨化患者的韧带细胞施加应力刺激,发现上述指标的表达明显上调,且流式细胞仪检测ROS水平升高,与刺激前相比差异有统计学意义(p<0.05);抑制PERK介导的ERS可显著下调应力刺激诱导的成骨标志物的表达(p<0.05)。(2)免疫组化检测p38 MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相关指标的磷酸化蛋白在骨化及非骨化组韧带中均有表达,但骨化组明显强于非骨化组;机械应力刺激非骨化患者的韧带细胞后,WB检测发现上述指标的磷酸化蛋白含量明显升高(p<0.05);成功构建了Cx43的siRNA,从mRNA及蛋白水平进行评价其抑制效率均大于70%;干扰非骨化组韧带细胞的Cx43可明显抑制机械应力激活MAPK通路(p<0.05);干扰Cx43及特异性抑制p38 MAPK、ERK1/2通路可明显下调机械应力诱导COL I、OCN、ALP和Runx2等成骨标志物的表达(p<0.05),但在JNK通路抑制组差异无统计学意义(p>0.05),提示在OPLL过程中JNK通路的作用不显著。(3)干扰非骨化组韧带细胞内的Cx43可明显下调应力刺激诱导PERK、CHOP、GRP78的表达以及ROS水平(p<0.05),过表达Cx43后发现ERS相关指标及ROS水平均出现显著上调;抑制PERK介导的ERS可显著抑制机械应力激活MAPK通路(p<0.05);在干扰Cx43的前提下,非骨化组韧带细胞MAPK磷酸化和成骨分化受到抑制,再次激活PERK介导的ERS可以恢复机械应力对MAPK通路的激活以及成骨刺激作用。结论利用酶消化法可以在体外环境中成功分离、培养后纵韧带组织细胞,并可通过波形蛋白染色证实其来源。(1)机械应力可刺激后纵韧带细胞出现PERK介导的ERS,并可通过该反应促进韧带细胞骨向分化。(2)在机械应力作用下,Cx43可通过p38 MAPK、ERK1/2通路促进韧带骨化,除此之外,可能还通过其它的作用通路来影响OPLL的过程。(3)在应力刺激作用下,PERK介导的ERS可在Cx43的下游通过ERK1/2、p38 MAPK通路促进韧带骨化,除此之外,可能也还通过其他机制调控OPLL。