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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)作为我国传统大宗药材之一需求量逐年上升,并且作为研究次生代谢合成和调控的“模式药用植物”而备受关注。丹参中有效成分主要分为水溶性的丹酚酸和脂溶性的丹参酮。茉莉酸(Jasmonic acid,JA)作为一种重要的植物激素在植物次生代谢物质诱导产生中起着重要作用,外源施加茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)能够通过同时诱导丹酚酸和丹参酮生源合成途径上相关基因的表达从而促进丹参中两类有效成分的积累,但其中的调控机制尚未研究清楚。JASMONATE ZIM DOMAIN(JAZ)蛋白家族作为JA信号通路中的抑制因子已被广泛报道参与调控植物多种次生代谢产物的合成积累,而且家族不同成员之间功能具有冗余性和特异性。本研究以丹参毛状根为材料,对SmJAZ基因家族在MeJA诱导的丹酚酸和丹参酮合成积累过程中的调控作用进行了研究,进一步探讨了SmJAZs功能的冗余性和特异性,并对其调控机理进行了分析。取得的主要结果如下:1.分析了丹参次生代谢物积累组织特异性及其对MeJA的响应。对开花期丹参不同组织部位的有效成分含量进行测定,发现迷迭香酸和丹酚酸B在地上和地下部分各组织中均有积累,而丹参酮只在根中积累,并且在根周皮中含量最高。用100μM MeJA处理丹参毛状根6 d后发现,丹酚酸B和总丹酚酸的含量显著提高,分别达到了对照的2.12倍和1.55倍;二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA和总丹参酮的含量显著提高,分别达到了对照的1.45倍、1.55倍、1.13倍和1.35倍;丹酚酸和丹参酮生源合成途径上的相关基因表达量均显著提高。2.全基因组鉴定分析了丹参SmJAZ基因家族。克隆得到了9条SmJAZs基因的全长序列,分别命名为SmJAZ1、SmJAZ2、SmJAZ3、SmJAZ4、SmJAZ5、SmJAZ6、SmJAZ8、SmJAZ9和SmJAZ10。进化树分析表明,双子叶植物JAZ可以分为5个亚族,其中SmJAZ1/2/5/6属于第I亚族,SmJAZ10属于第III亚族,SmJAZ8属于第IV亚族,SmJAZ3/4/9属于第V亚族。氨基酸序列比对发现,所有SmJAZs均含有ZIM和Jas结构域,SmJAZ8的Jas结构域缺失保守的LPIAR基序,SmJAZ1/2/5/6/8的N端含有LxLxL类型的EAR基序。分析发现SmJAZs的启动子区都含有MYC2结合元件G-box,以及响应非生物胁迫、与生长发育或初生代谢相关的作用元件。3.明确了丹参SmJAZ基因家族成员的表达模式。组织特异性表达分析发现,SmJAZ3/4在丹参幼苗期和开花期根中的表达量均显著高于地上部分,SmJAZ4在根周皮中特异性表达。其他SmJAZs在丹参幼苗期地上部分和地下部分表达量无显著差异,而在开花期丹参的茎、叶中的表达量显著高于其他部分的组织。MeJA处理后SmJAZs的表达量均显著上升,其中SmJAZ8的表达量在诱导0.5 h后达到最高值是对照的89.6倍;SmJAZ1/2/5/6表达量在诱导1 h后达到最高值,分别是对照的41.5倍、11.3倍、138.4倍和10.6倍;SmJAZ10表达量在诱导6 h后达到最高值是对照的133.8倍;SmJAZ3/4/9的表达量在诱导12-24 h后达到最高值,分别是对照的3.9倍、23.0倍和3.2倍。不同诱导子处理下SmJAZs表达量均出现不同程度的变化,表明该基因家族可能参与激素信号途径交叉互作。4.确定了丹参SmJAZ基因家族在丹酚酸和丹参酮合成积累中的作用。利用发根农杆菌ATCC15834介导的转化方法获得了过表达SmJAZs的转基因毛状根。在MeJA处理下,阳性株系中丹酚酸B的含量均显著降低,分别过表达SmJAZ1/2/5/6/9的株系中丹参酮含量显著升高,分别过表达SmJAZ3/4/8同时降低了毛状根中丹酚酸B和丹参酮的含量。过表达株系中丹酚酸合成相关基因SmRAS1和SmCYP98A14的表达量显著降低,而丹参酮合成相关基因SmCPS1和SmCYP76AH1的表达量无明显变化规律,表明不同SmJAZs在调控JA诱导的丹参酮合成过程中的分子机制有所不同。此外,过表达单一SmJAZ显著影响了其他SmJAZs的表达,表明家族成员之间存在共调控作用。5.筛选得到了丹参SmJAZ-SmJAZ蛋白互作及与SmJAZs互作的转录因子。Y2H分析结果表明,除SmJAZ5外,其他SmJAZs可以和SmMYC2a、SmMYB39互作,SmJAZ1/2/3/4可以和SmMYC2b互作,SmJAZ1/2可以和SmPAP1互作。组织特异性表达分析发现与SmJAZs互作的转录因子存在时空表达特异性。在MeJA处理下,SmMYC2a、SmMYC2b和SmPAP1的表达量显著上升,而SmMYB39的表达量显著下降。除了SmJAZ5/6,其他SmJAZs均可以形成同源二聚体,大部分SmJAZs可以形成异源二聚体。6.阐明了SmJAZ8在负反馈调节丹酚酸和丹参酮生物合成过程中的功能。在MeJA处理下,SmJAZ8-RNAi毛状根中丹酚酸和丹参酮的含量均显著提高,并且丹参酮合成相关基因SmCPS1和SmCYP76AH1的表达量显著上升,而丹酚酸合成相关基因SmRAS1和SmCYP98A14的表达量无显著变化或显著降低,表明SmJAZ8-RNAi可能抑制了其他处于SmCYP98A14下游的迷迭香酸衍生物的合成积累。RNA-Seq结果表明同时受JA和SmJAZ8调控的差异表达基因主要富集在初生代谢、胁迫响应以及转录调控途径上,表明SmJAZ8参与JA信号诱导的丹参初生代谢和次生代谢之间的转录调控。本研究证明了SmJAZ基因家族参与JA信号诱导下丹参中酚酸类和酮类物质的合成,并且家族中不同成员在起源进化、序列结构、时空表达、诱导表达、蛋白互作等特性上具有冗余性和特异性。